本文選題：胡楊 + 擬南芥��； 參考：《北京林業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：低溫是影響植物生長和作物產(chǎn)量的重要環(huán)境因子。當(dāng)溫度低于0℃時,由于細(xì)胞外的水分凝結(jié)成冰晶,植物細(xì)胞同時遭受到脫水脅迫和機(jī)械脅迫。低溫脅迫降低質(zhì)膜的完整性,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶物包括ATP釋放到胞外。胞內(nèi)ATP通過主動轉(zhuǎn)運(yùn)或被動擴(kuò)散釋放到胞外后,胞外的ATP(extracellular ATP,eATP)就成為重要的信號分子。eATP信號參與調(diào)控多種生理過程,且其介導(dǎo)的生理反應(yīng)依賴于eATP的濃度。另外,eATP在調(diào)節(jié)防御反應(yīng)中起重要作用。研究表明,eATP信號參與植物對多種環(huán)境脅迫的響應(yīng),比如病原體入侵、機(jī)械損傷、高鹽脅迫和高滲脅迫。但eATP是否參與植物對低溫脅迫的響應(yīng),目前還屬未知。在動物和植物中,胞外三磷酸雙磷酸核苷水解酶(Ecto-apyrase)是調(diào)控eATP水平的關(guān)鍵酶。對模式植物擬南芥的研究表明,擬南芥中的Apyrase參與調(diào)節(jié)植物生長和防御反應(yīng),包括花粉管的萌發(fā)、棉纖維伸長、根毛生長以及氣孔運(yùn)動等。研究表明有Apyrase可能通過調(diào)節(jié)eATP信號參與植物對脅迫刺激的應(yīng)答。然而,對于高等植物中的Apyrase是否在低溫下調(diào)節(jié)eATP信號、及其與低溫耐受性的關(guān)系至今尚未有報道。本文對木本植物Apyrase和eATP在植物耐受低溫脅迫中的作用進(jìn)行研究。我們選擇胡楊為研究材料。胡楊是分布于我國西北地區(qū)重要的木本植物,它具有較強(qiáng)的耐鹽堿、耐低溫的能力,對保持生態(tài)環(huán)境、防風(fēng)固沙具有重要作用。另外,胡楊還能適應(yīng)鹽堿荒漠地帶極端的溫度變化。我們發(fā)現(xiàn),低溫脅迫導(dǎo)致胡楊愈傷細(xì)胞質(zhì)膜的完整性受損,從而使eATP含量的升高。與之相對應(yīng)是,低溫處理誘導(dǎo)了胡楊A(yù)pyrase基因PeAPY2的表達(dá),卻對胡楊中另一個Apyrase同源基因PeAPY1的表達(dá)沒有促進(jìn)作用。因此,我們推測PeAPY2可能參與胡楊對低溫脅迫的適應(yīng)過程。為了驗(yàn)證這一推論,我們從胡楊細(xì)胞中克隆了PeAPY2基因的全長編碼區(qū),并研究了其在植物耐受低溫脅迫中的功能。主要結(jié)論如下：1. 我們將PeAPY2-YFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞和擬南芥原生質(zhì)體中進(jìn)行瞬時表達(dá),發(fā)現(xiàn)PeAPY2主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜,但在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中也有表達(dá),說明PeAPY2可能是通過細(xì)胞分泌途徑整合于質(zhì)膜之中。2.通過原核表達(dá)系統(tǒng)純化PeAPY2蛋白,分析了其酶學(xué)特性。發(fā)現(xiàn)PeAPY2有較廣的底物特異性,雖能水解多種嘌呤和嘧啶核苷酸,但PeAPY2對嘌呤核苷酸特別是ATP的親和力較高。PeAPY2以二價陽離子為輔因子,其中Mg2+的促進(jìn)作用最強(qiáng)。另外,抑制劑處理實(shí)驗(yàn)表明,PeAPY2對多種ATP酶(包括P型、V型、和F型ATP酶)的專一性抑制劑不敏感。3.通過在模式植物擬南芥中異源表達(dá)PeAPY2,我們研究了PeAPY2在調(diào)控eATP和低溫耐受性中的作用。在低溫脅迫下,PeAPY2過表達(dá)株系的抗低溫能力顯著提高,表現(xiàn)為冷凍處理時轉(zhuǎn)基因株系的根系生長和存活率顯著高于野生型。另外,根據(jù)相對電導(dǎo)率和細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,PeAPY2過表達(dá)株系在低溫下質(zhì)膜的完整性高于野生型。表明在低溫脅迫下,PeAPY2增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對質(zhì)膜損傷的修復(fù)能力。4.利用PeAPY2轉(zhuǎn)基因株系,通過進(jìn)一步分析低溫脅迫響應(yīng)基因和質(zhì)膜修復(fù)基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)PeAPY2轉(zhuǎn)基因株系中突觸結(jié)合蛋白基因(Synaptotagmin 1,AtSYT1)在冷脅迫下顯著上調(diào),說明PeAPY2可能借助于SYT1介導(dǎo)的質(zhì)膜修復(fù)提高低溫耐性。5.特別重要的發(fā)現(xiàn)是,PeAPY2過表達(dá)株系在低溫脅迫及恢復(fù)過程中根細(xì)胞的胞吞和胞吐顯著增強(qiáng)。研究結(jié)果還表明,低濃度的eATP促進(jìn)囊泡運(yùn)輸,而高濃度的eATP明顯抑制囊泡運(yùn)輸,并降低了細(xì)胞活力。在低溫下,野生型植株eATP含量明顯升高,而轉(zhuǎn)基因植株的eATP濃度顯著低于野生型植株。表明PeAPY2過表達(dá)株系能夠有效調(diào)控eATP水平,降低高濃度ATP對囊泡運(yùn)輸潛在的抑制作用。綜上所述,在低溫脅迫下,細(xì)胞內(nèi)ATP通過受損的質(zhì)膜釋放到胞外。eATP過度累積會抑制細(xì)胞活力和囊泡運(yùn)輸水平,阻礙低溫下的質(zhì)膜修復(fù),降低植物細(xì)胞的低溫耐性。PeAPY2通過促進(jìn)細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸,提高低溫下細(xì)胞的質(zhì)膜修復(fù)能力,維持細(xì)胞的完整性。另一方面,通過降解過多的eATP,減弱eATP對細(xì)胞活力和囊泡運(yùn)輸?shù)囊种谱饔?從而提高了植物的低溫耐性。在胡楊中,低溫處理的細(xì)胞上調(diào)PeAPY2的表達(dá)。PeAPY2在增強(qiáng)囊泡運(yùn)輸?shù)耐瑫r減少了eATP的過度積累,從而降低了高濃度eATP對囊泡運(yùn)輸和質(zhì)膜修復(fù)的抑制作用,最終提高了抗低溫能力。
[Abstract]:The effects of eATP on plant growth and defense responses , such as pathogen invasion , mechanical damage , root hair growth and stomatal movement , have not been reported . PeAPY2 - YFP fusion protein was transiently expressed in epidermal cells of onion and protoplasts of Arabidopsis thaliana , and it was found that PeAPY2 was mainly located in the cytoplasmic membrane , but also expressed in the endoplasmic reticulum and golgi .
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S792.11
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本文編號：1999626