本文選題：落葉松 + 體細(xì)胞胚胎發(fā)生�。� 參考：《中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院》2017年博士論文

【摘要】：落葉松體細(xì)胞胚再生體系是對(duì)針葉樹(shù)進(jìn)行分子遺傳改良、研究裸子植物早期發(fā)育調(diào)控和形態(tài)發(fā)生的理想模式系統(tǒng)。然而在實(shí)踐中仍然存在體細(xì)胞胚畸形率高、萌發(fā)率低等問(wèn)題。前期研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR166a前體基因LaMIR166a后,落葉松體細(xì)胞胚頂端發(fā)育異常,這與生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸抑制劑N-1-萘基酞氨酸(N-1-naphthylphthalamic acid,NPA)處理的結(jié)果類似,表明miR166及其目標(biāo)基因LaHDZ31-34與生長(zhǎng)素信號(hào)途徑共同參與調(diào)控落葉松體細(xì)胞胚形態(tài)建成。本研究以落葉松胚性細(xì)胞系S287為受體材料,通過(guò)過(guò)表達(dá)LaMIR166a研究了胚性胚柄團(tuán)(Embryogenic Suspensor Mass,ESMs)成胚發(fā)育以及體細(xì)胞胚萌發(fā)過(guò)程中miR166a的功能,發(fā)現(xiàn)該過(guò)程中miR166a對(duì)生長(zhǎng)素信號(hào)途徑存在的調(diào)控作用。主要研究結(jié)果如下:(1)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,將LaMIR166a的過(guò)表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化落葉松ESMs,篩選出6個(gè)抗性細(xì)胞系,并獲得qRT-PCR驗(yàn)證。與野生型相比,過(guò)表達(dá)LaMIR166a表現(xiàn)為落葉松ESMs增殖速率減慢、子葉胚畸形子葉數(shù)目增多、萌發(fā)率增加以及轉(zhuǎn)化植株側(cè)根數(shù)目增加等。(2)在鑒定出落葉松IAA信號(hào)途徑相關(guān)基因LaNIT和LaARF基礎(chǔ)上,對(duì)它們的的表達(dá)模式進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)LaNIT和兩個(gè)LaARF基因在落葉松體細(xì)胞胚發(fā)育過(guò)程的早期發(fā)育階段上調(diào)表達(dá)。IAA檢測(cè)結(jié)果顯示,在此過(guò)程中IAA含量上升。表明落葉松體細(xì)胞胚發(fā)育的早期階段,LaNIT參與了IAA的生物合成,且IAA信號(hào)通路在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。(3)qRT-PCR結(jié)果顯示,LaNIT與LaHDZ31-34表達(dá)模式相吻合,均在胚胎發(fā)育早期表達(dá)急速上調(diào),說(shuō)明LaHDZ31-34對(duì)LaNIT可能存在正向調(diào)控。同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR166a與LaHDZ31-34在體細(xì)胞胚發(fā)育過(guò)程中不呈現(xiàn)完全負(fù)調(diào)控的表達(dá)模式,暗示miR166a對(duì)LaHDZ31-34的調(diào)控作用具有發(fā)育階段特異性。(4)提出了miR166a/HDZIPⅢ調(diào)控落葉松體細(xì)胞胚萌發(fā)的網(wǎng)絡(luò)模型。揭示了HDZIPⅢ在轉(zhuǎn)錄后受到miR166a的調(diào)控,并正向調(diào)控LaNIT的表達(dá),影響IAA的合成,進(jìn)而引起LaARF1和LaARF2表達(dá)的改變,調(diào)控落葉松體細(xì)胞胚的萌發(fā)。(5)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,將LaMIR166a的過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草,qRTPCR篩選后獲得3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。表型分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株主根長(zhǎng)度、基部直徑、側(cè)根密度、莖基部直徑以及莖節(jié)間長(zhǎng)度均顯著高于野生型;莖部切片、根部壓片和顯微觀察顯示,過(guò)表達(dá)LaMIR166a明顯促進(jìn)莖部木質(zhì)部的形成和發(fā)育,根毛數(shù)量增多、根毛增長(zhǎng)、形態(tài)彎折等。(6)針對(duì)LaMIR166a及其目標(biāo)基因LaHDZ31分別構(gòu)建了兩個(gè)CRISPR/Cas9載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,共獲得了33個(gè)抗性細(xì)胞系。經(jīng)HPT PCR檢測(cè),確定這些CRISPR/Cas9表達(dá)載體均已成功轉(zhuǎn)化落葉松胚性細(xì)胞系。對(duì)pZJP15載體抗性細(xì)胞系進(jìn)行酶切驗(yàn)證,結(jié)果呈陽(yáng)性;需要進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證。綜上所述,miR166/HD-ZIPⅢ在落葉松體細(xì)胞胚發(fā)生中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用,研究結(jié)果為進(jìn)一步研究裸子植物體細(xì)胞胚發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理以及獲得高效穩(wěn)定的干細(xì)胞繁育體系提供科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:In this study , we found that the expression of miR166a and LaHDZ31 - 34 in the development of somatic embryos of Larix gmelinii was significantly higher than that of wild type . ( 5 ) By using Agrobacterium - mediated genetic transformation method , three transgenic lines were obtained by transforming the over - expression vector into tobacco and qRTPCR . The phenotype analysis showed that the length of the main root , the diameter of the base , the density of the lateral root , the diameter of the base and the length of the stem were significantly higher than that of the wild type .
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S791.22

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10 喬琦,肖婭蘋,王U喼，

本文編號(hào)：1978148