本文選題：落葉松 + 體細胞胚胎發(fā)生��； 參考：《中國林業(yè)科學(xué)研究院》2017年博士論文

【摘要】：落葉松體細胞胚再生體系是對針葉樹進行分子遺傳改良、研究裸子植物早期發(fā)育調(diào)控和形態(tài)發(fā)生的理想模式系統(tǒng)。然而在實踐中仍然存在體細胞胚畸形率高、萌發(fā)率低等問題。前期研究發(fā)現(xiàn),過表達miR166a前體基因LaMIR166a后,落葉松體細胞胚頂端發(fā)育異常,這與生長素極性運輸抑制劑N-1-萘基酞氨酸(N-1-naphthylphthalamic acid,NPA)處理的結(jié)果類似,表明miR166及其目標(biāo)基因LaHDZ31-34與生長素信號途徑共同參與調(diào)控落葉松體細胞胚形態(tài)建成。本研究以落葉松胚性細胞系S287為受體材料,通過過表達LaMIR166a研究了胚性胚柄團(Embryogenic Suspensor Mass,ESMs)成胚發(fā)育以及體細胞胚萌發(fā)過程中miR166a的功能,發(fā)現(xiàn)該過程中miR166a對生長素信號途徑存在的調(diào)控作用。主要研究結(jié)果如下:(1)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,將LaMIR166a的過表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化落葉松ESMs,篩選出6個抗性細胞系,并獲得qRT-PCR驗證。與野生型相比,過表達LaMIR166a表現(xiàn)為落葉松ESMs增殖速率減慢、子葉胚畸形子葉數(shù)目增多、萌發(fā)率增加以及轉(zhuǎn)化植株側(cè)根數(shù)目增加等。(2)在鑒定出落葉松IAA信號途徑相關(guān)基因LaNIT和LaARF基礎(chǔ)上,對它們的的表達模式進行分析。發(fā)現(xiàn)LaNIT和兩個LaARF基因在落葉松體細胞胚發(fā)育過程的早期發(fā)育階段上調(diào)表達。IAA檢測結(jié)果顯示,在此過程中IAA含量上升。表明落葉松體細胞胚發(fā)育的早期階段,LaNIT參與了IAA的生物合成,且IAA信號通路在這個過程中發(fā)揮重要作用。(3)qRT-PCR結(jié)果顯示,LaNIT與LaHDZ31-34表達模式相吻合,均在胚胎發(fā)育早期表達急速上調(diào),說明LaHDZ31-34對LaNIT可能存在正向調(diào)控。同時發(fā)現(xiàn)miR166a與LaHDZ31-34在體細胞胚發(fā)育過程中不呈現(xiàn)完全負調(diào)控的表達模式,暗示miR166a對LaHDZ31-34的調(diào)控作用具有發(fā)育階段特異性。(4)提出了miR166a/HDZIPⅢ調(diào)控落葉松體細胞胚萌發(fā)的網(wǎng)絡(luò)模型。揭示了HDZIPⅢ在轉(zhuǎn)錄后受到miR166a的調(diào)控,并正向調(diào)控LaNIT的表達,影響IAA的合成,進而引起LaARF1和LaARF2表達的改變,調(diào)控落葉松體細胞胚的萌發(fā)。(5)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,將LaMIR166a的過表達載體轉(zhuǎn)化煙草,qRTPCR篩選后獲得3個轉(zhuǎn)基因株系。表型分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株主根長度、基部直徑、側(cè)根密度、莖基部直徑以及莖節(jié)間長度均顯著高于野生型;莖部切片、根部壓片和顯微觀察顯示,過表達LaMIR166a明顯促進莖部木質(zhì)部的形成和發(fā)育,根毛數(shù)量增多、根毛增長、形態(tài)彎折等。(6)針對LaMIR166a及其目標(biāo)基因LaHDZ31分別構(gòu)建了兩個CRISPR/Cas9載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,共獲得了33個抗性細胞系。經(jīng)HPT PCR檢測,確定這些CRISPR/Cas9表達載體均已成功轉(zhuǎn)化落葉松胚性細胞系。對pZJP15載體抗性細胞系進行酶切驗證,結(jié)果呈陽性;需要進一步測序驗證。綜上所述,miR166/HD-ZIPⅢ在落葉松體細胞胚發(fā)生中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用,研究結(jié)果為進一步研究裸子植物體細胞胚發(fā)育的分子調(diào)控機理以及獲得高效穩(wěn)定的干細胞繁育體系提供科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:In this study , we found that the expression of miR166a and LaHDZ31 - 34 in the development of somatic embryos of Larix gmelinii was significantly higher than that of wild type . ( 5 ) By using Agrobacterium - mediated genetic transformation method , three transgenic lines were obtained by transforming the over - expression vector into tobacco and qRTPCR . The phenotype analysis showed that the length of the main root , the diameter of the base , the density of the lateral root , the diameter of the base and the length of the stem were significantly higher than that of the wild type .
【學(xué)位授予單位】：中國林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S791.22

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本文編號：1978148