本文選題：IFN-γ + 奶牛乳腺上皮細胞　； 參考：《吉林大學》2016年博士論文

【摘要】：營養(yǎng)直接影響機體的免疫狀況,越來越多的研究證實日糧可以改變炎性細胞因子的釋放,為一些病癥的病因探討提供了新方向。我國優(yōu)質(zhì)牧草資源缺乏,秸稈粗飼料配合高精料的日糧模式很普遍。課題組在前期研究發(fā)現(xiàn),長期飼喂這種秸桿日糧的奶牛IFN-γ等細胞因子的分泌水平較高,可能會導致機體出現(xiàn)非感染性炎癥狀態(tài),成為多種疾病的誘因,但是,IFN-γ對奶牛乳腺疾病的影響尚不清楚。為此,本研究在建立原代奶牛乳腺上皮細胞(Bovine mammary epithelial cells,BMECs)體外培養(yǎng)平臺的基礎上,開展了IFN-γ對細胞增殖、乳脂乳蛋白合成及對病原的易感性等方面的影響及其分子機制研究;并對奶牛乳腺進行活體采樣,進行了體內(nèi)驗證。為飼料營養(yǎng)通過免疫調(diào)控乳腺泌乳及抗病力提供了新的基礎。通過活檢技術獲得奶牛乳腺組織,應用免疫組化等技術檢測顯示秸稈飼料組(Corn straw,CS)較苜蓿組(Mixed forage,MF)IFN-γ及其受體(IFNGR1、IFNGR2)表達顯著上調(diào);自噬分子標志物LC3-II及P62表達顯著變化,說明秸稈組自噬增強。為明確IFN-γ能否誘導BMECs自噬,運用Western blotting及透射電鏡分析等實驗方法分析IFN-γ誘導BMECs發(fā)生自噬。研究結(jié)果顯示IFN-γ處理BMECs,其自噬標志蛋白LC3-II表達升高,LC3點狀聚集物的形成以及自噬溶酶體等顯微結(jié)構(gòu)增多,自噬底物p62的降解增加。表明IFN-γ體內(nèi)體外均可誘導BMECs自噬。為進一步探索IFN-γ誘導BMECs自噬的分子機制,本研究應用質(zhì)譜、Western blotting等實驗技術證實IFN-γ加速精氨酸耗竭,激活氨基酸感受器GCN2,增加e IF2a磷酸化調(diào)控自噬。相反,補充精氨酸可減少GCN2/e IF2a信號通路活化并抑制自噬。進一步通過RNA干擾GCN2明顯抑制了IFN-γ誘導的BMECs中LC3-II的表達及p62的降解。表明IFN-γ加速精氨酸耗竭活化GCN2/e IF2α信號途徑介導了BMECs細胞自噬。為確定自噬的發(fā)生對BMECs功能的影響,應用MTT、流式細胞術等方法檢測顯示激活自噬加速BMECs細胞周期進程,細胞生長加快,在軟瓊脂中形成細胞克隆能力增強表明BMECs發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。進一步研究顯示,上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(EMT)并不參與這一過程,而自噬促進c-Abl入核增加HDAC2的穩(wěn)定性,加強對細胞周期相關蛋白的調(diào)控,加速細胞周期進程。泌乳是BMECs最重要的功能,本研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ通過活化自噬抑制乳脂乳蛋白的合成。通過自噬抑制劑干預自噬潮的形成,能夠逆轉(zhuǎn)IFN-γ抑制的乳脂乳蛋白合成,而自噬激動劑誘導自噬潮的形成,能夠加劇IFN-γ抑制的乳脂乳蛋白合成。提示自噬介導了IFN-γ抑制的乳脂乳蛋白合成。補充精氨酸可減少GCN2/e IF2a信號通路活化并抑制自噬恢復乳脂肪乳蛋白合成。應用電鏡觀察等方法探討了IFN-γ誘導的自噬在BMECs抵抗金黃色葡萄球菌感染中的作用。結(jié)果顯示ITGA4參與了金黃色葡萄球菌粘附和侵入BMECs。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)包裹菌體,平板計數(shù)顯示抑制自噬,胞內(nèi)菌明顯增加,相反,增強自噬,胞內(nèi)菌計數(shù)明顯減少。表明自噬促進胞內(nèi)菌清除。綜上所述,IFN-γ在體內(nèi)體外促進自噬。精氨酸耗竭活化GCN2/e IF2a信號途徑介導了自噬的發(fā)生。自噬促進細胞惡性增殖、轉(zhuǎn)化,抑制乳脂乳蛋白合成,有助于BMECs胞內(nèi)金黃色葡萄球菌清除。本研究揭示了IFN-γ在BMECs誘導自噬及其分子機制,不僅為乳脂乳蛋白合成調(diào)控與乳腺免疫防御開辟了新的領域,也為防治乳腺相關疾病提供了新的思路與實驗線索。
[Abstract]:Nutrition directly affects the immune status of the body. More and more studies have confirmed that diet can change the release of inflammatory cytokines and provide a new direction for the discussion of the etiology of some diseases. The lack of high quality pasture resources in China is very common. The secretory level of IFN- gamma and other cytokines in dairy cows on straw diet is high, which may lead to non infectious inflammatory state and become a cause of various diseases. However, the effect of IFN- gamma on mammary disease of dairy cows is not clear. Therefore, this study is to establish the primary mammary epithelial cells (Bovine mammary epithelial cells, BMECs). On the basis of the external culture platform, the effects of IFN- gamma on cell proliferation, lactating milk protein synthesis and susceptibility to pathogenic factors and its molecular mechanism were carried out. The expression of Corn straw (CS) in the straw feed group (Mixed forage, MF) IFN- y and its receptor (IFNGR1, IFNGR2) was significantly up-regulated in the straw feed group (Mixed forage, MF), and the expression of the autophagy marker LC3-II and P62 was significantly increased. Western blotting and transmission electron microscopy were used to analyze the autophagy of BMECs induced by IFN- gamma. The results showed that IFN- gamma treated BMECs, the expression of autophagic marker protein LC3-II increased, LC3 dot aggregation, autophagosome and other microstructures increased, and the degradation of autophagic substrate p62 increased. The results showed that IFN- gamma in vitro and in vivo were both in vitro and in vitro In order to further explore the autophagy of BMECs. In order to further explore the molecular mechanism of IFN- gamma induced autophagy, this study uses mass spectrometry, Western blotting and other experimental techniques to confirm that IFN- gamma accelerates arginine depletion, activates the amino acid receptor GCN2 and increases the IF2a phosphorylation of e to regulate autophagy. On the contrary, the addition of arginine can reduce the activation and inhibition of GCN2/e IF2a signaling pathway. Autophagy. Further interfering with GCN2 by RNA interference significantly inhibits the expression of LC3-II and degradation of p62 in BMECs induced by IFN- gamma. It is indicated that IFN- gamma accelerates the depletion of arginine to activate GCN2/e IF2 alpha signal pathway to mediate the autophagy of BMECs cells. In order to determine the effect of autophagy on BMECs function, MTT, flow cytometry, and other methods are used to detect the activation of the autophagy. By accelerating the process of BMECs cell cycle and accelerating cell growth, the enhancement of cell cloning ability in soft agar indicates a malignant transformation of BMECs. Further research shows that epithelial cell mesenchymal cell transformation (EMT) does not participate in this process, and autophagy promotes the stability of c-Abl into the nucleus and increases the stability of HDAC2, and strengthens the cell cycle related proteins. Regulation, accelerating cell cycle process. Lactating is the most important function of BMECs. This study found that IFN- gamma inhibits the synthesis of milk protein by activating autophagy. By interfering with autophagy formation by autophagy inhibitors, it can reverse the synthesis of milk protein in IFN- gamma inhibition, and autophagic agonists induce the formation of autophagic tides, which can aggravate the IFN- gamma inhibition The synthesis of milk fat milk protein suggests that autophagy mediates the synthesis of milk fat milk protein in IFN- gamma inhibition. Supplementation of arginine can reduce the activation of GCN2/e IF2a signaling pathway and inhibit autophagy to restore milk fat milk protein synthesis. The effect of autophagy induced by IFN- gamma in BMECs resistance to Staphylococcus aureus infection was investigated by means of electron microscopy. The results showed that ITGA4 was involved in the adhesion and invasion of Staphylococcus aureus by BMECs. transmission electron microscopy. The double layer membrane structure was found. The plate count showed that the autophagy was inhibited and the intracellular bacteria increased obviously. On the contrary, the autophagy was enhanced and the count of intracellular bacteria decreased obviously. The autophagy promoted the removal of intracellular bacteria. In conclusion, IFN- gamma promoted autophagy in body and body in vitro and in vitro. The depletion of ammonia and activation of GCN2/e IF2a signal pathway mediates the occurrence of autophagy. Autophagy promotes cell proliferation, transformation, inhibits milk protein synthesis and helps to remove Staphylococcus aureus in BMECs cells. This study revealed that IFN- gamma induced autophagy in BMECs and its molecular mechanism, not only for milk fat milk protein synthesis regulation and mammary immune defense. It has opened up new fields and provided new clues and experimental clues for the prevention and treatment of breast related diseases.
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S823

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