本文選題：落葉松 + 體細(xì)胞胚發(fā)生��； 參考：《中國林業(yè)科學(xué)研究院》2017年博士論文

【摘要】：落葉松是我國北方中高山地區(qū)重要的速生造林用材樹種。落葉松體細(xì)胞胚發(fā)生是細(xì)胞工程規(guī)�；庇睦硐雽�(shí)驗(yàn)體系,也為林木基因功能研究提供了優(yōu)良材料。本課題組已經(jīng)對(duì)落葉松體細(xì)胞胚發(fā)生的形態(tài)發(fā)生、生理生化、分子調(diào)控等不同層次進(jìn)行了研究,揭示了落葉松體細(xì)胞胚發(fā)生過程中胚性維持以及畸形胚率高等分子機(jī)制。近年研究證明氫分子作為一種新型的抗氧化劑或信號(hào)分子,在植物和動(dòng)物中有促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)控細(xì)胞周期與凋亡,緩解氧化損傷以及延緩細(xì)胞衰老等功能。但是目前外源氫處理對(duì)植物體細(xì)胞胚的作用尚不清楚。本研究旨在通過在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中進(jìn)行氫處理(富氫培養(yǎng))優(yōu)化落葉松體細(xì)胞胚發(fā)生體系,進(jìn)一步研究富氫培養(yǎng)對(duì)早期原胚(pro-embryogenic masses,PEMs)和子葉胚發(fā)育的影響及mRNAs、miRNAs的分子調(diào)控機(jī)制,主要結(jié)果如下:1、分析了富氫培養(yǎng)對(duì)落葉松S287細(xì)胞系的PEMs胚性維持、PEMIII發(fā)育的同步化及子葉胚數(shù)量和質(zhì)量的影響,結(jié)果表明:與對(duì)照相比,富氫培養(yǎng)的早期原胚增殖鮮重提高了18.9%,PEMIII同步化率提高了25.4%,活性PEMIII提高了12.9%;持續(xù)富氫培養(yǎng)后早期子葉胚形成率提高了10.3%,正常成熟子葉胚的形成率提高了19.4%。早期原胚的ROS水平降低了53.6%,SOD、CAT和POD抗氧化酶活性分別提高了89.2%、76%、21.4%。這些結(jié)果表明氫參與調(diào)控了早期原胚和子葉胚的發(fā)育。2、構(gòu)建了富氫和對(duì)照培養(yǎng)0 h、12 h、48 h、7 d、21 d和36 d的PEMs 22個(gè)cDNA文庫,通過RNA-seq測(cè)序,共獲得572103351個(gè)clean reads,de novo組裝后得到62729個(gè)轉(zhuǎn)錄本(transcripts)和45393個(gè)基因(unigenes)。鑒定得到4253個(gè)差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),與對(duì)照相比,富氫培養(yǎng)后2379個(gè)DEGs上調(diào)表達(dá),1874個(gè)DEGs下調(diào)表達(dá)。GO/KEGG富集分析表明許多DEGs與ROS穩(wěn)態(tài)平衡調(diào)節(jié)、細(xì)胞程序化死亡、細(xì)胞周期調(diào)控和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑密切相關(guān)。3、進(jìn)一步對(duì)上述材料進(jìn)行miRNA測(cè)序,共獲得了315個(gè)miRNAs,分析發(fā)現(xiàn)有49個(gè)miRNAs分屬于40個(gè)已知保守miRNAs家族�；趍iRNA*對(duì)應(yīng)序列和miRNA特征莖環(huán)結(jié)構(gòu),鑒定了266個(gè)新miRNAs。23個(gè)保守miRNAs家族成員在早期原胚階段和體細(xì)胞胚成熟階段都表達(dá),但表達(dá)量差異明顯;有17和16個(gè)保守miRNAs分別在早期原胚階段和體細(xì)胞胚階段特異性表達(dá)。這些結(jié)果表明更多的未知的miRNAs參與調(diào)控了落葉松早期原胚發(fā)育以及體細(xì)胞胚發(fā)生過程中早期原胚發(fā)育階段與體細(xì)胞胚成熟階段具有明顯不同的miRNAs表達(dá)譜。4、篩選獲得96個(gè)差異表達(dá)的mi RNAs,與對(duì)照相比,49個(gè)上調(diào)表達(dá),47個(gè)下調(diào)表達(dá)。進(jìn)一步預(yù)測(cè)了285個(gè)miRNAs對(duì)應(yīng)4399個(gè)目標(biāo)基因。在12 h、48 h、7 d、21 d和36d文庫中,分別有8、13、5、7和8個(gè)差異表達(dá)的miRNAs,調(diào)控了8、40、5、9和10個(gè)差異表達(dá)的目標(biāo)基因。其中,共有42對(duì)miRNAs與其調(diào)控的目標(biāo)基因之間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系,并構(gòu)建了miRNAs-目標(biāo)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明miRNAs與mRNAs共同協(xié)調(diào)參與早期原胚對(duì)富氫培養(yǎng)的響應(yīng)通路。5、克隆并鑒定了落葉松關(guān)鍵抗氧化酶—銅鋅超氧化物歧化酶基因LlCuZnSOD。通過生物信息學(xué)、序列比對(duì)和分子系統(tǒng)樹分析發(fā)現(xiàn)CuZnSOD在細(xì)菌、植物和動(dòng)物中高度保守。qRT-PCR結(jié)果顯示LlCuZnSOD在早期原胚發(fā)育階段表達(dá)活躍并在體細(xì)胞胚成熟早期達(dá)到峰值,而在體細(xì)胞胚成熟晚期急劇下降。通過原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)中。綜上所述,富氫培養(yǎng)促進(jìn)落葉松早期原胚增殖和發(fā)育同步化,延緩細(xì)胞衰老,提高胚性細(xì)胞存活率,促進(jìn)落葉松體細(xì)胞胚成熟,提高正常成熟子葉胚形成率。因此,富氫培養(yǎng)可以用來優(yōu)化落葉松體細(xì)胞胚發(fā)生體系。而且轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明落葉松早期原胚對(duì)外源氫的響應(yīng)應(yīng)答涉及多條生物學(xué)途徑和過程。落葉松早期原胚在富氫培養(yǎng)過程中基因和mi RNAs的表達(dá)水平變化及miRNAs-目標(biāo)基因網(wǎng)絡(luò)將有助于更全面地了解氫在落葉松早期原胚發(fā)育過程中調(diào)控作用的分子機(jī)理。另外,這些分析不僅為將來進(jìn)一步解析落葉松體細(xì)胞胚發(fā)生的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新的視角和數(shù)據(jù)資源,也為落葉松細(xì)胞工程規(guī)�；庇纳a(chǎn)實(shí)踐提供了確實(shí)可行的方法。
[Abstract]:钀藉彾鏉炬槸鎴戝浗鍖楁柟涓珮灞卞湴鍖洪噸瑕佺殑閫熺敓閫犳灄鐢ㄦ潗鏍?wèi)绉?钀藉彾鏉句綋緇嗚優(yōu)鑳氬彂鐢熸槸緇嗚優(yōu)宸ョ▼瑙勬ā鍖栫箒鑲茬殑鐞嗘兂瀹為獙浣撶郴,涔熶負(fù)鏋楁湪鍩哄洜鍔熻兘鐮旂┒鎻愪緵浜?jiǎn)浼樿壇鏉愭枺?

本文編號(hào)：1974417