本文關(guān)鍵詞：豬傳染性胃腸炎病毒感染ST細胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《西北農(nóng)林科技大學(xué)》 2015年

豬傳染性胃腸炎病毒感染ST細胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究

馬瑞麗  

【摘要】：由豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的豬傳染性胃腸炎是一種急性腸道傳染病,以2周齡以下仔豬嘔吐、脫水、嚴重腹瀉,極高發(fā)病率和病死率(可達100%)為特征。該病的發(fā)生給世界養(yǎng)豬國家?guī)砹司薮蟮膿p失。但關(guān)于該病毒的分子致病機制尚未完全清楚,且基于TGEV感染宿主細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究較少。豬睪丸(ST)細胞對TGEV病毒很敏感,常用來增殖、分離TGEV病毒。本研究用ST細胞作為靶細胞,采用同位素標記相對和絕對定量(i TRAQ)結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(2D LC-MS/MS)高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對TGEV感染和未感染的ST細胞進行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析,獲得了TGEV感染宿主細胞差異表達蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù),并利用生物信息學(xué)方法對差異表達蛋白進行分析,以期發(fā)現(xiàn)新的診斷、預(yù)防和治療靶標,為揭示TGEV致病機制奠定基礎(chǔ)。具體內(nèi)容和結(jié)果如下:(1)為了確定4重-i TRAQ標記蛋白質(zhì)組學(xué)分析樣品的時間,首先應(yīng)用ST細胞進行TGEV感染試驗,對TGEV感染引起的細胞病變效應(yīng)(CPE)進行觀察,并用RT-PCR試驗對感染細胞中TGEV基因進行檢測,用q RT-PCR對病毒基因組RNA的復(fù)制的動態(tài)變化進行分析。結(jié)果顯示,在感染后40~64 h,感染組細胞均出現(xiàn)明顯病變;在感染后48 h,80%以上細胞出現(xiàn)典型CPE及細胞中病毒基因m RNA水平達到高峰;感染后64 h,細胞嚴重病變并出現(xiàn)大量細胞變圓脫落,細胞中病毒基因m RNA水平快速下降,可能與隨著病毒作用時間延長,宿主細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答及感染細胞活力下降有關(guān)。為此確定TGEV感染后48 h和64 h細胞樣品用于后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析。(2)采用i TRAQ標記結(jié)合2D LC-MS/MS技術(shù)對感染和未感染TGEV的細胞樣品進行了蛋白質(zhì)分離和鑒定,并用Protein pilot 4.0軟件對鑒定到的蛋白質(zhì)進行定量分析,搜庫后共獲得29 214個不同肽段,鑒定到4 112個可信蛋白。在此基礎(chǔ)上,對蛋白表達比值分布進行了分析,確定了差異蛋白所處的范圍(比值≤0.25或者比值≥4)。根據(jù)這一標準,共篩選到316個顯著性差異表達蛋白,其中,與未感染細胞相比,感染48 h引起ST細胞146個蛋白的表達有顯著差異,感染64 h引起219個蛋白的表達出現(xiàn)顯著差異。該結(jié)果顯示ST細胞在病毒感染后64 h,發(fā)生了較大數(shù)量的蛋白質(zhì)組變化。(3)以所有鑒定到的蛋白為背景,對差異表達蛋白進行GO富集分析。結(jié)果顯示這些差異蛋白在18類生物過程中顯著富集(p≤0.05),主要參與細胞黏附、應(yīng)激反應(yīng)、前體代謝物和能量的產(chǎn)生、蛋白質(zhì)成熟、蛋白復(fù)合體組裝、免疫系統(tǒng)過程、解剖結(jié)構(gòu)形成、細胞死亡、跨膜轉(zhuǎn)運、細胞運動等生物過程。感染48 h和64 h差異表達蛋白的GO富集分析結(jié)果顯示,兩個時間點的差異蛋白共同影響了6類生物過程,但應(yīng)激反應(yīng)、前體代謝物和能量的產(chǎn)生、免疫系統(tǒng)過程、蛋白復(fù)合體組裝、細胞運動、細胞生長6類生物過程僅在感染后64 h受到了較大影響。參與這些生物學(xué)過程的差異蛋白可能與病毒復(fù)制、免疫應(yīng)答、細胞病變等密切相關(guān)。(4)為確定差異蛋白質(zhì)參與的最主要的生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,進一步對差異蛋白進行KEGG pathway富集分析。結(jié)果顯示在差異蛋白質(zhì)中顯著富集(p≤0.05)的KEGG通路主要匹配在在碳水化合物代謝、能量代謝、氨基酸代謝、輔酶和維生素代謝、脂質(zhì)代謝類別中的16個通路,感染性疾病相關(guān)通路10個,免疫系統(tǒng)相關(guān)通路4個,消化及排泄系統(tǒng)相關(guān)通路3個,信號分子和互作過程相關(guān)通路2個,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路2個等共計61個。參與各種營養(yǎng)物質(zhì)代謝的相關(guān)通路,NOD-like受體信號途徑和RIG-I-like受體信號途徑2個免疫相關(guān)通路,感染性疾病相關(guān)通路,TNF和PI3K-Akt 2個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,只在感染64 h的差異蛋白中受到顯著影響。參與上述途徑的差異表達蛋白可能對TGEV感染及豬傳染性胃腸炎發(fā)病起重要的調(diào)控作用。(5)根據(jù)差異蛋白的表達變化趨勢和GO富集分析結(jié)果,挑選4個代表性差異表達蛋白HSP90α、TGFB1/TGF-β1、Caspase-8、DDX58/RIG-1進行了Western blot驗證,結(jié)果顯示其表達規(guī)律與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)基本一致,說明質(zhì)譜鑒定結(jié)果是可靠的。這些蛋白參與TGEV感染引起應(yīng)激反應(yīng)、細胞死亡、初始免疫應(yīng)答、細胞蛋白體復(fù)合物裝配等。本研究首次應(yīng)用i TRAQ技術(shù),對TGEV感染的宿主應(yīng)答蛋白質(zhì)組變化進行分析。據(jù)我們目前所知,對于差異表達蛋白的較為全面的生物信息學(xué)分析、病毒在快速復(fù)制期之后的蛋白質(zhì)組變化的分析及鑒定的免疫應(yīng)答相關(guān)差異表達蛋白在之前對TGEV感染的ST細胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究中沒有涉及。本研究鑒定的這些差異表達蛋白體現(xiàn)著宿主ST細胞對TGEV感染的總體反應(yīng)模式,為從病毒與宿主相互作用角度揭示TGEV的致病機理奠定了良好基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S855.3
【目錄】：

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  本文關(guān)鍵詞：豬傳染性胃腸炎病毒感染ST細胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：196843