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  本文關(guān)鍵詞：豬傳染性胃腸炎病毒感染ST細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《西北農(nóng)林科技大學(xué)》 2015年

豬傳染性胃腸炎病毒感染ST細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究

馬瑞麗  

【摘要】：由豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的豬傳染性胃腸炎是一種急性腸道傳染病,以2周齡以下仔豬嘔吐、脫水、嚴(yán)重腹瀉,極高發(fā)病率和病死率(可達(dá)100%)為特征。該病的發(fā)生給世界養(yǎng)豬國(guó)家?guī)?lái)了巨大的損失。但關(guān)于該病毒的分子致病機(jī)制尚未完全清楚,且基于TGEV感染宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究較少。豬睪丸(ST)細(xì)胞對(duì)TGEV病毒很敏感,常用來(lái)增殖、分離TGEV病毒。本研究用ST細(xì)胞作為靶細(xì)胞,采用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(i TRAQ)結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(2D LC-MS/MS)高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)TGEV感染和未感染的ST細(xì)胞進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析,獲得了TGEV感染宿主細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù),并利用生物信息學(xué)方法對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析,以期發(fā)現(xiàn)新的診斷、預(yù)防和治療靶標(biāo),為揭示TGEV致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。具體內(nèi)容和結(jié)果如下:(1)為了確定4重-i TRAQ標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)分析樣品的時(shí)間,首先應(yīng)用ST細(xì)胞進(jìn)行TGEV感染試驗(yàn),對(duì)TGEV感染引起的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)進(jìn)行觀察,并用RT-PCR試驗(yàn)對(duì)感染細(xì)胞中TGEV基因進(jìn)行檢測(cè),用q RT-PCR對(duì)病毒基因組RNA的復(fù)制的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,在感染后40~64 h,感染組細(xì)胞均出現(xiàn)明顯病變;在感染后48 h,80%以上細(xì)胞出現(xiàn)典型CPE及細(xì)胞中病毒基因m RNA水平達(dá)到高峰;感染后64 h,細(xì)胞嚴(yán)重病變并出現(xiàn)大量細(xì)胞變圓脫落,細(xì)胞中病毒基因m RNA水平快速下降,可能與隨著病毒作用時(shí)間延長(zhǎng),宿主細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答及感染細(xì)胞活力下降有關(guān)。為此確定TGEV感染后48 h和64 h細(xì)胞樣品用于后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析。(2)采用i TRAQ標(biāo)記結(jié)合2D LC-MS/MS技術(shù)對(duì)感染和未感染TGEV的細(xì)胞樣品進(jìn)行了蛋白質(zhì)分離和鑒定,并用Protein pilot 4.0軟件對(duì)鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析,搜庫(kù)后共獲得29 214個(gè)不同肽段,鑒定到4 112個(gè)可信蛋白。在此基礎(chǔ)上,對(duì)蛋白表達(dá)比值分布進(jìn)行了分析,確定了差異蛋白所處的范圍(比值≤0.25或者比值≥4)。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn),共篩選到316個(gè)顯著性差異表達(dá)蛋白,其中,與未感染細(xì)胞相比,感染48 h引起ST細(xì)胞146個(gè)蛋白的表達(dá)有顯著差異,感染64 h引起219個(gè)蛋白的表達(dá)出現(xiàn)顯著差異。該結(jié)果顯示ST細(xì)胞在病毒感染后64 h,發(fā)生了較大數(shù)量的蛋白質(zhì)組變化。(3)以所有鑒定到的蛋白為背景,對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO富集分析。結(jié)果顯示這些差異蛋白在18類生物過(guò)程中顯著富集(p≤0.05),主要參與細(xì)胞黏附、應(yīng)激反應(yīng)、前體代謝物和能量的產(chǎn)生、蛋白質(zhì)成熟、蛋白復(fù)合體組裝、免疫系統(tǒng)過(guò)程、解剖結(jié)構(gòu)形成、細(xì)胞死亡、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等生物過(guò)程。感染48 h和64 h差異表達(dá)蛋白的GO富集分析結(jié)果顯示,兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異蛋白共同影響了6類生物過(guò)程,但應(yīng)激反應(yīng)、前體代謝物和能量的產(chǎn)生、免疫系統(tǒng)過(guò)程、蛋白復(fù)合體組裝、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞生長(zhǎng)6類生物過(guò)程僅在感染后64 h受到了較大影響。參與這些生物學(xué)過(guò)程的差異蛋白可能與病毒復(fù)制、免疫應(yīng)答、細(xì)胞病變等密切相關(guān)。(4)為確定差異蛋白質(zhì)參與的最主要的生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,進(jìn)一步對(duì)差異蛋白進(jìn)行KEGG pathway富集分析。結(jié)果顯示在差異蛋白質(zhì)中顯著富集(p≤0.05)的KEGG通路主要匹配在在碳水化合物代謝、能量代謝、氨基酸代謝、輔酶和維生素代謝、脂質(zhì)代謝類別中的16個(gè)通路,感染性疾病相關(guān)通路10個(gè),免疫系統(tǒng)相關(guān)通路4個(gè),消化及排泄系統(tǒng)相關(guān)通路3個(gè),信號(hào)分子和互作過(guò)程相關(guān)通路2個(gè),信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路2個(gè)等共計(jì)61個(gè)。參與各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的相關(guān)通路,NOD-like受體信號(hào)途徑和RIG-I-like受體信號(hào)途徑2個(gè)免疫相關(guān)通路,感染性疾病相關(guān)通路,TNF和PI3K-Akt 2個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,只在感染64 h的差異蛋白中受到顯著影響。參與上述途徑的差異表達(dá)蛋白可能對(duì)TGEV感染及豬傳染性胃腸炎發(fā)病起重要的調(diào)控作用。(5)根據(jù)差異蛋白的表達(dá)變化趨勢(shì)和GO富集分析結(jié)果,挑選4個(gè)代表性差異表達(dá)蛋白HSP90α、TGFB1/TGF-β1、Caspase-8、DDX58/RIG-1進(jìn)行了Western blot驗(yàn)證,結(jié)果顯示其表達(dá)規(guī)律與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)基本一致,說(shuō)明質(zhì)譜鑒定結(jié)果是可靠的。這些蛋白參與TGEV感染引起應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞死亡、初始免疫應(yīng)答、細(xì)胞蛋白體復(fù)合物裝配等。本研究首次應(yīng)用i TRAQ技術(shù),對(duì)TGEV感染的宿主應(yīng)答蛋白質(zhì)組變化進(jìn)行分析。據(jù)我們目前所知,對(duì)于差異表達(dá)蛋白的較為全面的生物信息學(xué)分析、病毒在快速?gòu)?fù)制期之后的蛋白質(zhì)組變化的分析及鑒定的免疫應(yīng)答相關(guān)差異表達(dá)蛋白在之前對(duì)TGEV感染的ST細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究中沒有涉及。本研究鑒定的這些差異表達(dá)蛋白體現(xiàn)著宿主ST細(xì)胞對(duì)TGEV感染的總體反應(yīng)模式,為從病毒與宿主相互作用角度揭示TGEV的致病機(jī)理奠定了良好基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S855.3
【目錄】：

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7 李霞;張春紅;趙亞華;張建峰;;TGEV和PEDV多重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及其細(xì)胞分離培養(yǎng)研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第四次豬病防控學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

8 黃小波;曹三杰;文心田;;豬傳染性胃腸炎病毒檢測(cè)基因芯片的初步構(gòu)建[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第六屆理事會(huì)第二次會(huì)議暨教學(xué)專業(yè)委員會(huì)第六屆代表大會(huì)論文集[C];2006年

9 黃小波;曹三杰;文心田;;豬傳染性胃腸炎病毒檢測(cè)基因芯片的初步構(gòu)建[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2006學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2006年

10 李娜;黃小波;曹三杰;文心田;;豬傳染性胃腸炎病毒重組N蛋白單克隆抗體的制備及鑒定[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第三屆豬病防控學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 馬瑞麗;豬傳染性胃腸炎病毒感染ST細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

2 蘭喜;豬傳染性胃腸炎病毒的分子診斷與免疫研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2006年

3 丁利;TGEV誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

4 安康;TGEV感染PK-15細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)及誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 王龍濤;豬傳染性胃腸炎病毒纖突蛋白基因體外克隆表達(dá)及鑒定[D];吉林大學(xué);2010年

6 彭樹英;TGEV S基因的克隆、表達(dá)及轉(zhuǎn)基因小鼠的制備[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

7 楊恒;豬傳染性胃腸炎病毒DNA疫苗的構(gòu)建與免疫原性研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

8 周俊芳;shRNA表達(dá)載體抗豬傳染性胃腸炎病毒感染的研究[D];上海交通大學(xué);2007年

9 王承寶;TGE華毒強(qiáng)、弱毒株的全基因組分子差異及基于BAC反向遺傳系統(tǒng)的初探[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

10 李建強(qiáng);兩種豬腹瀉冠狀病毒基因組克隆及載體構(gòu)建[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王雪;TGEV S-AD蛋白親和肽的篩選及鑒定[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

2 曾作財(cái);TGEV-S基因在玉米植株中的表達(dá)[D];福建農(nóng)林大學(xué);2010年

3 魏廣麗;干酪乳桿菌表面展示表達(dá)TGEV-S抗原表位及其免疫原性分析[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2008年

4 魯娜;TGEV纖突糖蛋白保護(hù)性抗原基因克隆、測(cè)序及表達(dá)[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

5 佟玲;豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）種毒的特性研究與制備[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

6 屈月;TGEV雙抗體夾心ELISA方法建立與膠體金免疫層析試紙條的制備[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

7 鐘濤;間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)TGEV方法的建立[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

8 高長(zhǎng)春;豬腸道抗TGEV益生菌株篩選及其體外抗病毒作用[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

9 秦學(xué)遠(yuǎn);TGEV S基因減毒鼠傷寒沙門氏菌重組活載體疫苗株的初步構(gòu)建[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

10 衛(wèi)文強(qiáng);抗豬傳染性胃腸炎病毒中草藥的篩選及作用機(jī)制初步研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

  本文關(guān)鍵詞：豬傳染性胃腸炎病毒感染ST細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：196843