本文關鍵詞：中國荷斯坦牛TRIB3和SAA家族基因?qū)Ξa(chǎn)奶性狀的遺傳效應分析及功能驗證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國農(nóng)業(yè)大學》 2015年

中國荷斯坦牛TRIB3和SAA家族基因?qū)Ξa(chǎn)奶性狀的遺傳效應分析及功能驗證

楊少華  

【摘要】：本課題組前期研究針對兩頭高乳蛋白率、乳脂率與兩頭低乳蛋白率、乳脂率的泌乳期中國荷斯坦奶牛的乳腺上皮組織進行了轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq),得到31個與脂肪和蛋白質(zhì)代謝、乳腺生長發(fā)育相關的差異表達基因,并通過整合分析RNA-Seq、QTL、GWAS及生物學功能結果,最終將TRIB3,VEGFA,PTHLH和SAA家族基因確定為產(chǎn)奶性狀重要候選功能基因。本研究旨在將這些差異基因與中國荷斯坦奶牛的產(chǎn)奶性狀進行遺傳效應分析、尋找關鍵致因突變并對候選關鍵基因進行功能驗證。 (1)候選基因與奶牛產(chǎn)奶性狀的遺傳效應分析：本研究選擇21頭中國荷斯坦公牛作為試驗群體,利用混池測序?qū)蜻x基因全部編碼區(qū)及上游2000bp調(diào)控區(qū)進行SNP檢測,共發(fā)現(xiàn)29個SNPs。通過SNaPshot、飛行時間質(zhì)譜、PCR-RFLP多色熒光標記四種技術對717頭中國荷斯坦牛群體進行基因型分型。與產(chǎn)奶性狀單標記SNP關聯(lián)分析結果表明,TRIB3和SAA家族基因都至少與2個產(chǎn)奶性狀關聯(lián)程度達到顯著或者極顯著水平(p0.05或p0.01),VEGFA和PTHLH基因檢測到的SNPs與產(chǎn)奶性狀關聯(lián)均不顯著。同時,單倍型分析的結果基本與單標記遺傳分析的結果一致。另外,組織表達譜分析表明SAA3.2基因在乳腺組織中特異性高表達,而TRIB3基因在肝臟組織中特異性高表達。 (2)關鍵突變位點的功能驗證：針對遺傳效應顯著的5'調(diào)控區(qū)位點,通過在線預測軟件TFSEARCH預測轉(zhuǎn)錄因子結合位點情況,并通過啟動子區(qū)活性檢測、凝膠阻滯試驗(EMSA)和超遷移凝膠阻滯試驗(super-shift EMSA)進行功能驗證。結果表明：SAA1基因位點c.-1788CT和c.-963CA均檢測到突變前后轉(zhuǎn)錄因子結合的改變,同時雙熒光素酶活性分析結果也驗證上述預測；SAA2基因的c.114GA位點通過改變mRNA的二級結構和結合不同的轉(zhuǎn)錄因子影響啟動子活性：SAA3.2基因的c.-1500AG突變前后熒光素酶活性分析的改變最大,通過super-shift EMSA試驗檢測到C/EBPβ轉(zhuǎn)錄因子的結合；TRIB3基因中檢測到一段52bp的增強子序列,并通過啟動子活性分析進行驗證。 (3)TRIB3和SAA3.2基因的功能驗證：MAC-T細胞系具有正常的乳腺上皮細胞的形態(tài)和特征,同時目的TRIB3和SAA3.2也在該細胞系中表達,適用于目的基因的功能驗證。瞬時轉(zhuǎn)染MAC-T細胞系,SAA3.2基因構建shRNA慢病毒表達載體的轉(zhuǎn)染效率在70～80%,而TRIB3基因慢病毒過表達載體的轉(zhuǎn)染效率在40～50%。轉(zhuǎn)染72h檢測TRIB3基因過表達和SAA3.2基因干擾后乳脂相關基因的表達情況,發(fā)現(xiàn)這些基因的表達趨勢一致,表明在影響奶牛乳脂性狀方面這兩個基因的作用途徑完全相反。同時,處理前后表達量變化最大的基因包含脂蛋白脂肪酶(LPL)基因、B類清道夫受體(CD36)、載脂蛋白1(APOA1)等參與乳脂轉(zhuǎn)運的基因,表明這兩個基因是通過參與乳脂的轉(zhuǎn)運過程影響奶牛的相關乳脂性狀。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S823
【目錄】：

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