本文關(guān)鍵詞：北京鴨胚胎期胸肌發(fā)育相關(guān)基因與miRNAs表達(dá)模式鑒定及其互作關(guān)系研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《復(fù)旦大學(xué)》 2012年

miRNAs對(duì)TBX5的靶向調(diào)控及其遺傳變異的調(diào)控差異在先天性心臟病中的作用

王鳳  

【摘要】：先天性心臟病(Congenital heart disease, CHD)是出生缺陷中最常見的類型,已成為嬰幼兒死亡和殘疾的首要原因。開展其相關(guān)的病因和發(fā)病機(jī)制的研究,是早期發(fā)現(xiàn)和早期干預(yù)的重要策略。目前已知多種轉(zhuǎn)錄因子與維持胚胎心臟的正常發(fā)育密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子TBX5基因編碼區(qū)序列突變是在人類第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的致病性突變,可引起包括房間隔缺損(ASD)、室間隔缺損(VSD)和傳導(dǎo)系統(tǒng)異常等在內(nèi)的Holt-Oram綜合征。長期以來,TBX5與人類CHD的相關(guān)研究側(cè)重于基因編碼區(qū),關(guān)注因氨基酸變化導(dǎo)致的基因功能異常是否會(huì)增加CHD易感性,而很少對(duì)基因調(diào)控區(qū)尤其是3'UTR進(jìn)行系統(tǒng)研究來探討基因劑量與CHD的關(guān)系。為了探討TBX5 3'UTR的遺傳變異和CHD易感性是否存在聯(lián)系,我們在山東和上海兩個(gè)省市收集了總計(jì)1,177例CHD病例和990例健康對(duì)照樣本,挑選出其中32個(gè)樣本對(duì)TBX5 3'UTR進(jìn)行了測序,根據(jù)測序結(jié)果挑選最小等位基因頻率(MAF)大于5%的SNPs,在兩個(gè)人群中分別進(jìn)行基因分型和關(guān)聯(lián)分析。我們發(fā)現(xiàn),TBX53'UTR rs6489956 CT多態(tài)位點(diǎn)可顯著增加先心病的患病風(fēng)險(xiǎn),并在兩個(gè)人群中得到了一致的結(jié)果。其中,T等位基因?yàn)轱L(fēng)險(xiǎn)因子,與CC基因型相比,CT-TT基因型能提高1.9倍的患病風(fēng)險(xiǎn)(adjusted OR= 1.90,95%Cl= 1.52-2.38, P=8.79×10-9)。分層分析發(fā)現(xiàn),該位點(diǎn)與多種類型CHD存在關(guān)聯(lián),且在室間隔缺損(VSD)中較為突出(CT:OR=1.61,95%CI=1.23-2.10；TT:OR=2.43,95% CI=1.04-5.65,P=4×10-4)。在找到與疾病易感性相關(guān)的陽性位點(diǎn)后,我們進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行了功能上的分析。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明,攜帶rs6489956 T等位基因的CT-TT基因型患病個(gè)體心臟組織TBX5 mRNA的表達(dá)水平僅為CC基因型個(gè)體的49.3%。細(xì)胞水平的熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)顯示,miR-9和miR-30a對(duì)rs6489956 CT不同等位基因的負(fù)調(diào)控存在差異。進(jìn)一步的qRT-PCR和Western blot表明,該多態(tài)由C到T的變化會(huì)增強(qiáng)miR-9和miR-30a對(duì)TBX5基因的抑制作用,表現(xiàn)為miR-9引起細(xì)胞內(nèi)源TBX5 mRNA和蛋白水平的表達(dá)下調(diào),而miR-30a則主要抑制TBX5蛋白翻譯。為了鑒定更多的靶向調(diào)控TBX5的miRNAs,根據(jù)生物信息學(xué)的預(yù)測結(jié)果,我們通過細(xì)胞水平的熒光素酶篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-10a和miR-10b均可引起熒光素酶表達(dá)下調(diào)。隨后的qRT-PCR和Western blot證實(shí), miR-10a和miR-10b對(duì)HEK 293T細(xì)胞內(nèi)源TBX5 mRNA的表達(dá)無顯著影響,但可引起其蛋白水平的顯著下調(diào)；而miR-10a或miR-10b抑制劑則上調(diào)TBX5蛋白水平的表達(dá)。ANF是TBX5的下游基因之一,其啟動(dòng)子區(qū)具有TBX5的結(jié)合位點(diǎn)。因此,我們進(jìn)一步檢測了miR-10a/10b對(duì)于ANF的作用。HEK 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí),miR-10a/10b均可顯著抑制熒光素酶的活性,而在內(nèi)源低表達(dá)TBX5的Hela細(xì)胞中卻未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。隨后的qRT-PCR結(jié)果顯示miR-10a/10b可以下調(diào)HEK293T細(xì)胞內(nèi)源ANF mRNA的表達(dá)。通過以上研究,我們首次鑒定出TBX5 3'UTR rs6489956 CT多態(tài)可顯著增加CHD的患病風(fēng)險(xiǎn),miR-9和miR-30a對(duì)T等位基因的負(fù)調(diào)控作用更為顯著,從而導(dǎo)致TBX5基因的表達(dá)差異；首次發(fā)現(xiàn)miR-10a/10b能夠通過直接靶向TBX5 3'UTR而抑制TBX5蛋白水平的表達(dá)和下游ANF的轉(zhuǎn)錄。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R725.4
【目錄】：

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