本文關(guān)鍵詞：CCL2-CCR2自分泌在胚胎附植期豬子宮內(nèi)膜的表達(dá)分布和功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2015年

CCL2-CCR2自分泌在胚胎附植期豬子宮內(nèi)膜的表達(dá)分布和功能研究

樊自堯  

【摘要】：產(chǎn)仔數(shù)是豬的重要經(jīng)濟(jì)性狀,胚胎附植期分子機(jī)理研究對(duì)豬產(chǎn)仔數(shù)的提高具有重要意義。CCL2(CC chemokine ligand2, CC趨化因子配體2)被報(bào)道表達(dá)在人、羊等附植階段的子宮內(nèi)膜,但調(diào)節(jié)機(jī)制和生物學(xué)功能還不清楚。本論文針對(duì)CCL2和其受體CCR2(CC chemokine receptor2)CC趨化因子配體2)在胚胎附植期豬子宮內(nèi)膜的表達(dá)調(diào)控和其影響豬子宮內(nèi)膜的胚胎附植的生物學(xué)功能進(jìn)行了研究。 本研究首先對(duì)CCL2和CCR2在豬子宮內(nèi)膜的表達(dá)進(jìn)行定位,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCL2和CCR2同時(shí)表達(dá)在豬子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞。通過對(duì)妊娠第13天、第18天和第24天,以及發(fā)情周期第13天和第18天的豬子宮內(nèi)膜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件相同的免疫組化來檢測CCL2和CCR2的表達(dá)量的變化。結(jié)果表明,CCL2和CCR2的表達(dá)量發(fā)情周期高于胚胎附植期；在發(fā)情周期第13天子宮內(nèi)膜腔上皮表達(dá)的CCL2和CCR2高于第18天的子宮內(nèi)膜腔上皮；CCL2和CCR2在所有附植點(diǎn)腔上皮表達(dá)低于附植點(diǎn)間；附植點(diǎn)和附植點(diǎn)間的CCR2表達(dá)量在在妊娠第13天開始表達(dá)量升高,妊娠第18天達(dá)到峰值,之后開始下降;附植點(diǎn)和附植點(diǎn)間的CCL2的表達(dá)量隨妊娠進(jìn)行而逐漸下降,說明CCL2和CCR2的變化可能與胚胎附植期的豬子宮內(nèi)膜調(diào)控機(jī)制有關(guān)。 實(shí)驗(yàn)建立了豬原代子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法,獲得了原代豬子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞。為了研究CCL2和CCR2之間是否存在自分泌現(xiàn)象,對(duì)細(xì)胞分別添加豬CCL2重組蛋白、CCR2阻斷劑(RS102895)和RS102895+CCL2重組蛋白等處理,以及對(duì)照組。結(jié)果表明,CCL2可以促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)CCR2,添加RS102895或RS102895+CCL2重組蛋白的細(xì)胞,會(huì)劇烈上調(diào)CCR2的表達(dá)；各試驗(yàn)組細(xì)胞表達(dá)CCL2mRNA的變化沒有顯著變化。說明CCL2和CCR2之間存在正調(diào)控方式的自分泌,CCR2被RS102895阻斷后,CCR2出現(xiàn)劇烈的上調(diào)。實(shí)驗(yàn)檢測了孕酮對(duì)豬子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞表達(dá)CCL2和CCR2的影響。向原代豬子宮腔上皮細(xì)胞中添加孕酮,用Westernblotting檢測CCL2和CCR2的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)孕酮可以促進(jìn)CCL2和CCR2的表達(dá)；向卵巢切除的母豬注射孕酮,免疫組化結(jié)果顯示,注射孕酮的母豬的子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞CCL2和CCR2的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。說明孕酮對(duì)豬子宮內(nèi)膜腔上皮表達(dá)CCL2和CCR2具有促進(jìn)作用。 為了挖掘CCL2-CCR2信號(hào)在豬子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞存在的自分泌現(xiàn)象的生物學(xué)意義,實(shí)驗(yàn)分別用CCL2的重組蛋白,抗CCL2中和抗體與對(duì)照處理原代豬子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞,24小時(shí)后提取mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,實(shí)驗(yàn)組分別與對(duì)照組進(jìn)行比較,利用DE-Seq的方法并限定FC大于2或小于0.5,FDR小于0.01和RPKM大于10獲得差異基因,對(duì)照組和CCL2蛋白組沒有獲得差異基因,對(duì)照組和CCL2中和抗體組獲得48個(gè)差異基因,其中包括VEGFA、CEBPB、MIF、 MMP15、CLDN3等被報(bào)道與胚胎附植相關(guān)的11個(gè)基因。檢測了CCL2對(duì)細(xì)胞增殖的影響,CCL2中和抗體添加到細(xì)胞中,處理不同時(shí)間后CCK8檢測細(xì)胞增殖發(fā)現(xiàn)高濃度CCL2可以抑制細(xì)胞增殖,但CCL2重組蛋白添加后細(xì)胞增殖情況與對(duì)照組沒有顯著差異。實(shí)驗(yàn)通過血清饑餓豬子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞模型檢測了CCL2-CCR2對(duì)饑餓導(dǎo)致的細(xì)胞自噬作用,結(jié)果顯示CCL2促進(jìn)自噬,防止細(xì)胞死亡。綜上,合適濃度的CCL2-CCR2可以維持豬子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞的正常存活,對(duì)胚胎附植的順利進(jìn)行具有重要的意義。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S828
【目錄】：

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【參考文獻(xiàn)】

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