本文選題：中華絨螯蟹 + 蛻殼　； 參考：《上海海洋大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：中華絨螯蟹(Eroicheir sinensis),俗稱河蟹、大閘蟹,是我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。蛻殼是甲殼動(dòng)物重要的生物學(xué)現(xiàn)象,河蟹的生長(zhǎng)和再生都是通過(guò)蛻殼來(lái)完成的。本研究首先對(duì)中華絨螯蟹不同蛻殼階段的肝胰腺組織進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析,在篩選到差異表達(dá)基因即蛻皮激素受體基因(ecdysone receptor,EcR)的基礎(chǔ)上,聚焦與其具有拮抗作用的蛻皮抑制激素基因(molt-inhibiting hormone,MIH),對(duì)這兩個(gè)基因在蛻殼過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)特征及相互調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下:1.中華絨螯蟹蛻殼周期內(nèi)的基因表達(dá)特征研究本實(shí)驗(yàn)采用RNA-Seq測(cè)序技術(shù)對(duì)中華絨螯蟹同一蛻殼周期內(nèi)的肝胰腺轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析,共獲得了97,398個(gè)轉(zhuǎn)錄本,注釋了31,900個(gè)轉(zhuǎn)錄本,找到了1,189個(gè)差異表達(dá)基因。根據(jù)這些差異表達(dá)基因,我們構(gòu)建了河蟹一個(gè)蛻殼周期內(nèi)關(guān)于能量代謝和生理調(diào)控的表達(dá)模式圖。結(jié)果表明,在蛻殼后期,差異表達(dá)基因主要與能量消耗有關(guān),該階段是保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài),殼硬化和恢復(fù)的階段;在蛻殼間期,差異表達(dá)基因主要集中在碳水化合物合成、脂類代謝和生物合成方面,該階段主要是能量?jī)?chǔ)存過(guò)程,是生長(zhǎng)發(fā)育的重要階段;在蛻殼前期,主要是應(yīng)對(duì)激素和類固醇的刺激,為下一次蛻殼進(jìn)行準(zhǔn)備的階段,高表達(dá)的基因主要與脂類合成和免疫發(fā)育相關(guān)。此外,本實(shí)驗(yàn)還利用qPCR技術(shù)對(duì)12個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行了驗(yàn)證,并發(fā)現(xiàn)蛻皮激素受體基因(ecdysone receptor,EcR)在蛻殼前期的表達(dá)量顯著高于蛻殼后期。本研究通過(guò)對(duì)河蟹肝胰腺組織進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析,揭示了河蟹蛻殼過(guò)程中的能量變化過(guò)程,找到了不同蛻殼階段的差異表達(dá)基因,篩選出與蛻殼相關(guān)的重要基因,即蛻皮激素受體基因(ecdysone receptor,EcR),為進(jìn)一步研究河蟹蛻殼機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。2.中華絨螯蟹內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)估熒光定量PCR(qPCR)結(jié)果的準(zhǔn)確性與所選取的內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性密不可分。因此,為了獲得準(zhǔn)確的qPCR結(jié)果,通常要對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估。本實(shí)驗(yàn)中,選取了10個(gè)常用的內(nèi)參基因(包括從第二章轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出來(lái)的3個(gè)內(nèi)參基因UBE、α-TUB和β-ACTIN及7個(gè)從NCBI上下載的河蟹內(nèi)參基因AK、GST、HSP90、S27、VATB、GAPDH和Na K),分析其在中華絨螯蟹不同發(fā)育階段、不同組織和不同蛻殼階段中的表達(dá)水平,結(jié)合常用的內(nèi)參評(píng)估軟件geNorm、NormFinder和Best Keeper對(duì)這些內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明,ubiquitin-conjugating enzyme E2b(UBE)和ubiquitin/ribosomal S27 fusion protein(S27)是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因;而常用的內(nèi)參基因glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)和beta-actin(β-ACTIN)在河蟹不同發(fā)育階段的表達(dá)穩(wěn)定性卻很差。此外,研究還發(fā)現(xiàn)為了獲得更為準(zhǔn)確的基因表達(dá)結(jié)果,通常要選取2-3個(gè)穩(wěn)定的內(nèi)參基因進(jìn)行校準(zhǔn)。為了驗(yàn)證內(nèi)參基因篩選的準(zhǔn)確性,本實(shí)驗(yàn)還分別選取不同的內(nèi)參基因進(jìn)行校準(zhǔn)來(lái)分析Ec R基因在不同蛻殼階段的表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)使用最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因glutathione S-transferase(GST)做校準(zhǔn)時(shí),EcR基因在蛻殼前期的表達(dá)量顯著高于以最穩(wěn)定的3個(gè)內(nèi)參基因作為校準(zhǔn)的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)篩選出來(lái)的內(nèi)參基因可以用于后續(xù)的基因表達(dá)研究,同時(shí)為其它甲殼動(dòng)物基因表達(dá)研究中內(nèi)參的選擇提供參考依據(jù)。3.EcR與MIH基因在中華絨螯蟹蛻殼過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)特征分析鑒于有關(guān)Ec R與MIH基因的表達(dá)研究主要集中在mRNA水平上,而對(duì)其蛋白水平的研究較少。本部分實(shí)驗(yàn)采用Western blot技術(shù)分析了EcR與MIH基因在不同組織及不同蛻殼階段中蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明,在蛻殼前期EcR基因的蛋白表達(dá)量顯著高于蛻殼后期,而MIH基因的蛋白表達(dá)水平正好與之相反,其在蛻殼前期顯著低于蛻殼后期。MIH蛋白在眼柄組織中高表達(dá),在肌肉和心臟組織中也有表達(dá);EcR蛋白在河蟹的表皮和肌肉組織中大量表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)EcR和MIH基因進(jìn)行熒光免疫組化分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MIH基因主要在細(xì)胞膜和細(xì)胞間質(zhì)中表達(dá),其在蛻殼前期的熒光信號(hào)強(qiáng)度顯著低于蛻殼后期;EcR基因在蛻殼前期的熒光信號(hào)強(qiáng)度高于蛻殼后期,在前期主要表達(dá)在細(xì)胞核中,在蛻殼后期則主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中,少量在細(xì)胞核中。此外,本實(shí)驗(yàn)還采用ELISA方法對(duì)河蟹蛻殼周期內(nèi)的蛻皮激素含量進(jìn)行了連續(xù)測(cè)量,結(jié)果表明在蛻殼周期內(nèi)蛻皮激素的含量呈波動(dòng)性變化,且推測(cè)當(dāng)其含量達(dá)到12 IU/mL且持續(xù)上升時(shí),河蟹將啟動(dòng)蛻殼。4.EcR與MIH基因的相互調(diào)節(jié)機(jī)制研究本部分實(shí)驗(yàn)采用RNAi技術(shù)和注射MIH基因的抗體及重組蛋白的方法探討了EcR與MIH基因的功能互作關(guān)系,同時(shí)通過(guò)沉默EcR和MIH基因,及注射MIH基因的抗體和重組蛋白來(lái)觀察河蟹蛻殼情況,進(jìn)一步驗(yàn)證了EcR和MIH基因在河蟹蛻殼中的作用。研究結(jié)果表明,通過(guò)體內(nèi)注射雙鏈RNA可以成功地敲減EcR與MIH基因,初步建立了河蟹RNA干擾系統(tǒng)。當(dāng)敲減EcR基因時(shí),MIH基因的表達(dá)量也降低;當(dāng)敲減MIH基因時(shí),EcR基因的表達(dá)量卻上升。通過(guò)注射MIH基因的抗體和重組蛋白發(fā)現(xiàn),在48h內(nèi),注射MIH抗體可以顯著降低MIH基因的表達(dá)量,在注射12h后EcR基因的表達(dá)量顯著下降,而24h和48h后EcR基因的表達(dá)量又顯著上升;在48h內(nèi),注射MIH重組蛋白可以顯著提高M(jìn)IH基因的表達(dá)量,而EcR基因的表達(dá)量卻顯著下降。本實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn),敲減MIH基因可以顯著加速河蟹蛻殼;而敲減EcR基因會(huì)延緩?fù)憵?同時(shí)增加河蟹的死亡率;注射MIH重組蛋白會(huì)導(dǎo)致河蟹蛻殼延遲且大量死亡。
[Abstract]:In the early stage of molting , the gene expression in the molting cycle of the crab was studied . The results showed that the expression of ecdysone receptor ( EcR ) was mainly related to the energy expenditure . The results showed that the expression of EcR gene was significantly higher than that at the later stage of molting . The results showed that the expression of EcR gene was significantly higher than that in the later stage of molting .
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：1922571