發(fā)布時間：2018-05-22 15:06

  本文選題：中華絨螯蟹 + 蛻殼��； 參考：《上海海洋大學》2017年博士論文

【摘要】：中華絨螯蟹(Eroicheir sinensis),俗稱河蟹、大閘蟹,是我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟動物。蛻殼是甲殼動物重要的生物學現(xiàn)象,河蟹的生長和再生都是通過蛻殼來完成的。本研究首先對中華絨螯蟹不同蛻殼階段的肝胰腺組織進行比較轉錄組分析,在篩選到差異表達基因即蛻皮激素受體基因(ecdysone receptor,EcR)的基礎上,聚焦與其具有拮抗作用的蛻皮抑制激素基因(molt-inhibiting hormone,MIH),對這兩個基因在蛻殼過程中的時空表達特征及相互調(diào)節(jié)機制進行了研究。主要研究結果如下:1.中華絨螯蟹蛻殼周期內(nèi)的基因表達特征研究本實驗采用RNA-Seq測序技術對中華絨螯蟹同一蛻殼周期內(nèi)的肝胰腺轉錄組進行了分析,共獲得了97,398個轉錄本,注釋了31,900個轉錄本,找到了1,189個差異表達基因。根據(jù)這些差異表達基因,我們構建了河蟹一個蛻殼周期內(nèi)關于能量代謝和生理調(diào)控的表達模式圖。結果表明,在蛻殼后期,差異表達基因主要與能量消耗有關,該階段是保持細胞穩(wěn)態(tài),殼硬化和恢復的階段;在蛻殼間期,差異表達基因主要集中在碳水化合物合成、脂類代謝和生物合成方面,該階段主要是能量儲存過程,是生長發(fā)育的重要階段;在蛻殼前期,主要是應對激素和類固醇的刺激,為下一次蛻殼進行準備的階段,高表達的基因主要與脂類合成和免疫發(fā)育相關。此外,本實驗還利用qPCR技術對12個差異表達基因進行了驗證,并發(fā)現(xiàn)蛻皮激素受體基因(ecdysone receptor,EcR)在蛻殼前期的表達量顯著高于蛻殼后期。本研究通過對河蟹肝胰腺組織進行比較轉錄組分析,揭示了河蟹蛻殼過程中的能量變化過程,找到了不同蛻殼階段的差異表達基因,篩選出與蛻殼相關的重要基因,即蛻皮激素受體基因(ecdysone receptor,EcR),為進一步研究河蟹蛻殼機制提供了理論基礎。2.中華絨螯蟹內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評估熒光定量PCR(qPCR)結果的準確性與所選取的內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性密不可分。因此,為了獲得準確的qPCR結果,通常要對內(nèi)參基因進行穩(wěn)定性評估。本實驗中,選取了10個常用的內(nèi)參基因(包括從第二章轉錄組數(shù)據(jù)中篩選出來的3個內(nèi)參基因UBE、α-TUB和β-ACTIN及7個從NCBI上下載的河蟹內(nèi)參基因AK、GST、HSP90、S27、VATB、GAPDH和Na K),分析其在中華絨螯蟹不同發(fā)育階段、不同組織和不同蛻殼階段中的表達水平,結合常用的內(nèi)參評估軟件geNorm、NormFinder和Best Keeper對這些內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進行了評估。結果表明,ubiquitin-conjugating enzyme E2b(UBE)和ubiquitin/ribosomal S27 fusion protein(S27)是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因;而常用的內(nèi)參基因glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)和beta-actin(β-ACTIN)在河蟹不同發(fā)育階段的表達穩(wěn)定性卻很差。此外,研究還發(fā)現(xiàn)為了獲得更為準確的基因表達結果,通常要選取2-3個穩(wěn)定的內(nèi)參基因進行校準。為了驗證內(nèi)參基因篩選的準確性,本實驗還分別選取不同的內(nèi)參基因進行校準來分析Ec R基因在不同蛻殼階段的表達情況。研究發(fā)現(xiàn),當使用最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因glutathione S-transferase(GST)做校準時,EcR基因在蛻殼前期的表達量顯著高于以最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因作為校準的結果。本實驗篩選出來的內(nèi)參基因可以用于后續(xù)的基因表達研究,同時為其它甲殼動物基因表達研究中內(nèi)參的選擇提供參考依據(jù)。3.EcR與MIH基因在中華絨螯蟹蛻殼過程中的時空表達特征分析鑒于有關Ec R與MIH基因的表達研究主要集中在mRNA水平上,而對其蛋白水平的研究較少。本部分實驗采用Western blot技術分析了EcR與MIH基因在不同組織及不同蛻殼階段中蛋白表達情況。結果表明,在蛻殼前期EcR基因的蛋白表達量顯著高于蛻殼后期,而MIH基因的蛋白表達水平正好與之相反,其在蛻殼前期顯著低于蛻殼后期。MIH蛋白在眼柄組織中高表達,在肌肉和心臟組織中也有表達;EcR蛋白在河蟹的表皮和肌肉組織中大量表達。進一步對EcR和MIH基因進行熒光免疫組化分析,結果發(fā)現(xiàn)MIH基因主要在細胞膜和細胞間質中表達,其在蛻殼前期的熒光信號強度顯著低于蛻殼后期;EcR基因在蛻殼前期的熒光信號強度高于蛻殼后期,在前期主要表達在細胞核中,在蛻殼后期則主要表達在細胞質中,少量在細胞核中。此外,本實驗還采用ELISA方法對河蟹蛻殼周期內(nèi)的蛻皮激素含量進行了連續(xù)測量,結果表明在蛻殼周期內(nèi)蛻皮激素的含量呈波動性變化,且推測當其含量達到12 IU/mL且持續(xù)上升時,河蟹將啟動蛻殼。4.EcR與MIH基因的相互調(diào)節(jié)機制研究本部分實驗采用RNAi技術和注射MIH基因的抗體及重組蛋白的方法探討了EcR與MIH基因的功能互作關系,同時通過沉默EcR和MIH基因,及注射MIH基因的抗體和重組蛋白來觀察河蟹蛻殼情況,進一步驗證了EcR和MIH基因在河蟹蛻殼中的作用。研究結果表明,通過體內(nèi)注射雙鏈RNA可以成功地敲減EcR與MIH基因,初步建立了河蟹RNA干擾系統(tǒng)。當敲減EcR基因時,MIH基因的表達量也降低;當敲減MIH基因時,EcR基因的表達量卻上升。通過注射MIH基因的抗體和重組蛋白發(fā)現(xiàn),在48h內(nèi),注射MIH抗體可以顯著降低MIH基因的表達量,在注射12h后EcR基因的表達量顯著下降,而24h和48h后EcR基因的表達量又顯著上升;在48h內(nèi),注射MIH重組蛋白可以顯著提高MIH基因的表達量,而EcR基因的表達量卻顯著下降。本實驗研究還發(fā)現(xiàn),敲減MIH基因可以顯著加速河蟹蛻殼;而敲減EcR基因會延緩蛻殼,同時增加河蟹的死亡率;注射MIH重組蛋白會導致河蟹蛻殼延遲且大量死亡。
[Abstract]:In the early stage of molting , the gene expression in the molting cycle of the crab was studied . The results showed that the expression of ecdysone receptor ( EcR ) was mainly related to the energy expenditure . The results showed that the expression of EcR gene was significantly higher than that at the later stage of molting . The results showed that the expression of EcR gene was significantly higher than that in the later stage of molting .
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

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本文編號：1922571