本文關鍵詞：PA-X基因影響A型流感病毒致病性的分子機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國農(nóng)業(yè)大學》 2015年

PA-X基因影響A型流感病毒致病性的分子機制

高慧杰  

【摘要】：近年來,流感病毒感染性與致病性的改變給公共衛(wèi)生安全造成了越來越嚴重的威脅。因此,流感病毒的毒力因子及致病機制研究對于流感的防控及抗病毒藥物的研制至關重要。最近研究發(fā)現(xiàn)流感病毒片段3不僅編碼PA蛋白,還編碼一種新型蛋白"PA-X"。PA-X是一種融合蛋白,其N-末端的191個氨基酸由PA開放閱讀框編碼,而C末端氨基酸由+1核糖體移碼而產(chǎn)生的開放閱讀框編碼。之前對PA-X的功能研究僅局限于1918H1N1歷史上流行的具有特殊性的病毒株。PA-X在當前流行的流感病毒毒株,包括2009大流行H1N1人群流行毒株以及H5亞型禽流感病毒中的功能及其作用機制需要進一步闡明。 為了了解PA-X基因在目前流行流感病毒中的功能及其作用機制,我們利用定點突變技術及反向遺傳操作技術構建了pHIN1和H5N1PA-X缺失病毒,通過比較分析pHINl和H5N1親本病毒及其對應的PA-X缺失病毒在體外細胞系及小鼠模型中的復制力及致病性,來探究PA-X基因在pH1N1和H5N1病毒中的作用。為了進一步揭示PA-X影響病毒致病性的機制,本研究評價了PA-X缺失后病毒的聚合酶活性、PA蛋白的表達水平以及PA蛋白的功能變化包括PA蛋白的核蓄積能力及PA蛋白抑制基因合成能力等。研究結果表明：(1)PA-X缺失增強了pH1N1和H5N1病毒在A549細胞中的復制水平及誘導A549細胞的凋亡水平。(2)小鼠實驗表明PA-X缺失顯著增強了pH1N1和H5N1病毒的致病性,這與PA-X缺失病毒在小鼠肺臟中的高水平復制和誘導產(chǎn)生高表達的炎性細胞因子有關。(3)進一步研究發(fā)現(xiàn)：PA-X缺失可能是通過提高pH1N1和H5N1病毒PA蛋白的表達水平,增強病毒的聚合酶活性,從而增強病毒的復制力及致病性。(4)PA-X缺失還影響PA蛋白功能。在pHlNl和H5N1病毒背景下,PA-X缺失的PA蛋白核蓄積能力明顯增強,然而其抑制共轉染基因的能力發(fā)生了顯著性下降,表明PA-X在抑制宿主蛋白合成中起到重要的作用。 PA-X基因遺傳進化分析表明,流感病毒根據(jù)PA-X的X-ORF長度可分為兩組：表達全長PA-X的病毒(X-ORF是61個氨基酸,全長252個氨基酸)和表達截短PA-X的病毒(X-ORF是41個氨基酸,全長232個氨基酸)。全長和截短的PA-X相差ORF C末端233-252位的20個氨基酸。所有的禽流感病毒包括H5N1和H9N2病毒均表達全長的PA-X蛋白,而以pHlNl病毒為代表表達截短的PA-X蛋白。然而,這兩種形式的PA-X蛋白在流感病毒中的功能是否相同仍不得而知。為了確定這兩種形式的PA-X在流感病毒中的功能是否存在差異,我們以pHIN1、H5N1和H9N2病毒為現(xiàn)流行于人群和禽群中的代表毒株探究了PA-X基因C末端20個氨基端對流感病毒復制力及致病性的影響。本研究通過延長pH1N1病毒的PA-X以及截短H5N1和H9N2病毒的PA-X,并評價PA-X延長或截短后病毒體內(nèi)外生物學特性的變化,以揭示PA-X蛋白C末端233-252位的20個氨基酸在流感病毒中的作用。研究結果表明：(1)在這三株病毒背景下,表達全長PA-X的病毒與表達截短PA-X的病毒相比能夠在人肺臟細胞系中更好的復制和誘導更高的細胞凋亡水平。(2)小鼠實驗表明表達全長PA-X的pHIN1、H5N1和H9N2病毒對小鼠致病性顯著強于其對應的PA-X截短病毒。表達全長PA-X的病毒較PA-X截短病毒在小鼠肺臟中的高病毒滴度和誘導的高表達的炎性細胞因子可能是其致病性增強的關鍵因素。(3)進一步實驗證明：PA-X延長或截短雖不影響PA蛋白的表達水平,但是表達全長PA-X的PA質粒較PA-X截短的PA質粒能夠更有效地抑制外源蛋白的表達。而且,體外共轉染pEGFP和只表達C末端20個氨基酸的質粒試驗直接驗證了PA-X基因C末端233-252位氨基酸具有強烈地抑制蛋白合成的能力。這一結果暗示：表達全長PA-X的病毒能夠更有效的抑制宿主蛋白的合成,有利于病毒本身的復制及傳播,這可能與其致病性增強密切相關。上述研究結果表明PA-X基因C末端233-252位氨基酸是A型流感病毒的重要毒力調控因子。 綜上所述,研究表明PA-X缺失可能通過上調PA蛋白的表達水平來增強病毒的聚合酶活性,從而有利于病毒本身的復制：PA-X缺失病毒誘導的細胞凋亡水平上調及宿主炎癥反應增強可能是其致病性增強的關鍵因素。PA-X蛋白C末端20個氨基酸能夠強烈抑制共轉染基因的表達,這可能會增強全長PA-X蛋白抑制宿主蛋白合成的能力,從而增強病毒體內(nèi)外的復制力及致病性。本研究解析了PA-X基因在調控目前流行流感病毒致病性及致病機制中的作用,并揭示了不同形式的PA-X基因在目前流行流感病毒中的功能差異,為闡明流感病毒致病性的分子機制奠定了重要的理論基礎。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

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