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  本文關鍵詞：高毒力大麗輪枝菌特異分泌蛋白基因功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國農(nóng)業(yè)科學院》 2015年

高毒力大麗輪枝菌特異分泌蛋白基因功能研究

徐明  

【摘要】：大麗輪枝菌(Verticillium dahliae,VD)的寄主范圍極廣,可以侵染600多種植物,其中主要農(nóng)作物184種,全球每年因其造成的經(jīng)濟損失超過10億美元。在棉花上引起的棉花黃萎病被稱為棉花的“癌癥”,是我國棉花生產(chǎn)上的第一大病害,嚴重影響我國棉花的產(chǎn)量。近年來的研究表明大麗輪枝菌胞外分泌蛋白是造成棉花黃萎、落葉和減產(chǎn)的主要因素之一,因此深入研究大麗輪枝菌的胞外分泌蛋白將為制定有效的防治棉花黃萎病提供理論依據(jù)。本實驗室前期通過二代測序技術對分離自棉花的高、低兩種致病類型的大麗輪枝菌開展了全基因組測序工作。通過比較基因組學分析得到了髙毒力大麗輪枝菌VDG1相對于低毒力菌株VDG2的11個特異大片段。利用Signal P 3.0、TMHMM 2.0、Wo LF PSORT、Phobius和Y-Loc等生物信息學方法對特異大片段上編碼的蛋白進行了分泌特性預測,并從中克隆了這11個特異大片段上6個特異分泌蛋白的編碼基因;并將這6個特異的分泌蛋白分別命名為HSSP1(HighVirulent Special Secreted Protein 1,HSSP1)、HSSP2、HSSP3、HSSP4、HSSP5和HSSP6。依據(jù)基因組測序信息,設計跨內(nèi)含子引物,分別通過PCR對這6個基因在VDG1中的特異性進行了驗證;通過Signal P 3.0預測了其信號肽的編碼序列,并利用酵母信號肽跟蹤系統(tǒng)對預測的信號肽序列進行了活性驗證。結果表明這6個信號肽序列均具有分泌活性,即這6個蛋白均為有活性的分泌蛋白。在此基礎上對VDG1在侵染感病寄主軍棉1號后的不同的侵染時間點檢測了這6個基因的表達情況,檢測表明這6個基因均在侵染早期被誘導表達。然后我們利用蔗糖、半乳糖、木糖、木聚糖、淀粉、果膠和纖維素等七個不同的單一碳源的培養(yǎng)基分析了VDG1中這6個基因在不同碳源營養(yǎng)條件下的表達情況,推測這6個基因可能參與了病原菌的早期侵染過程。為了明確這6個特異基因與大麗輪枝菌致病力之間的關系,建立了大麗輪枝菌由PEG介導的原生質體轉化體系,并通過該體系成功獲得了除HSSP4以外其它5個HSSPs基因。對這5個突變株的生物量(菌絲和孢子產(chǎn)量)進行了測定,結果發(fā)現(xiàn)突變株與野生型相比均明顯降低,但是突變株之間的生物量降低程度差異較大。對這5個突變株利用單一碳源培養(yǎng)基分析了突變體對測試碳源的利用情況,發(fā)現(xiàn)雖然突變體菌落形態(tài)上并未產(chǎn)生較大變化,但對碳源的利用上卻產(chǎn)生一定的差別。進而利用定量蘸根接種方法對這5個突變株進行了致病力測定,與野生型高達65的病情指數(shù)相比突變體的致病能力均有所下降,最高為50.27±1.34,最低為38.39±2.30。綜上所述,這6個蛋白均為有活性的分泌蛋白,除HSSP4以外的5個髙毒力大麗輪枝菌VDG1特異的分泌蛋白均在其致病過程中發(fā)揮了重要作用。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S432.4
【目錄】：

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