本文選題：水牛　切入點：睪丸曲精細管　出處：《廣西大學》2016年博士論文

【摘要】：睪丸內曲精細管是精子發(fā)生的重要場所,曲精細管組織主要由支持細胞和各級生精細胞組成,支持細胞為生精細胞提供營養(yǎng)物質并對精母細胞最終發(fā)育成完整形態(tài)的精子具有至關重要的作用。精子發(fā)生是一個冗長、復雜的過程,其參與了遺傳信息的傳遞,哺乳動物精子發(fā)生主要由三部分組成：精母細胞發(fā)生、減數分裂及精子形成,這一增殖分化過程由各種各樣的分泌因子所調控并受制于生精細胞和支持細胞間大量基因和蛋白的相互調節(jié)作用。曲精細管中的多種蛋白質在精子發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用,但究竟有哪些蛋白參與及其具體分子調節(jié)機制目前尚未清楚。水牛是廣西重要的經濟物種,具有耐粗飼、飼料轉化率高、乳品營養(yǎng)價值高等特點,但是其繁殖率低且整體研究水平不高,開展深入的基礎研究將有助于實現(xiàn)其更大的經濟價值。本研究將首次利用差異蛋白質組學的方法來比較不同時期(性成熟前期、性成熟期、性成熟后期)水牛睪丸曲精細管蛋白表達的差異,探索生精細胞和支持細胞在這三個不同發(fā)育時期蛋白質組成、含量等方面的變化,找出與水牛精子發(fā)生過程及其雄性生殖生理相關的標志性蛋白。主要采用雙向電泳技術和液相色譜分離兩大主流技術對不同時期水牛睪丸曲精細管差異蛋白進行研究,根據研究方法的不同,主要分為以下兩章：第一章,采用雙向電泳技術分析不同時期水牛睪丸曲精細管差異蛋白質組。主要包括兩個部分,首先是水牛睪丸曲精細管雙向電泳體系的建立和優(yōu)化。通過對不同IPG膠條(線性與非線性)及膠條pH值、蛋白質上樣量這三個參數進行比較和優(yōu)化,建立適合于水牛睪丸曲精細管蛋白質分離的雙向電泳體系。結果顯示,采用上樣量350μg的曲精細管總蛋白、24 cm且pH 4-7的線性IPG膠條能夠更好的分離水牛睪丸曲精細管蛋白質,獲得質量較好且分辨率較高的雙向電泳圖譜,通過對圖像的分析檢測,可得到大約486個蛋白點。其次,采用已優(yōu)化并建立的雙向電泳體系對不同時期(性成熟前期、性成熟期、性成熟后期)水牛睪丸曲精細管蛋白質進行分離,獲取差異蛋白質并進行質譜鑒定。結果顯示,以性成熟期水牛睪丸曲精細管蛋白表達圖譜作為對照,篩選出性成熟前期與性成熟期水牛睪丸曲精細管差異蛋白150個,性成熟期與性成熟后期水牛睪丸曲精細管差異蛋白92個。質譜成功鑒定出性成熟前期與性成熟期水牛睪丸曲精細管差異蛋白點4個,對應4種蛋白質,在性成熟前期水牛睪丸曲精細管中均表現(xiàn)為下調；鑒定出性成熟期與性成熟后期水牛睪丸曲精細管差異蛋白點15個并對應13種蛋白質,在性成熟后期水牛睪丸曲精細管中表達上調的有8個,下調4個,只在性成熟后期水牛睪丸曲精細管中表達的有1個。本章試驗建立了良好的水牛睪丸曲精細管雙向電泳體系,分析并鑒定了一批水牛睪丸曲精細管差異蛋白質,并找出可能與水牛精子發(fā)生相關的差異蛋白質,如超氧化物歧化酶、熱休克蛋白HSPA2、波形蛋白、抗增殖蛋白、細胞角蛋白KRT8及半乳凝集素1等。第二章,利用TMT定量標記結合二維液相色譜／質譜(2DLC-MS/MS)技術分析不同時期水牛睪丸曲精細管差異蛋白質組。主要包括三個部分,首先對不同時期(性成熟前期、性成熟期、性成熟后期)水牛睪丸曲精細管蛋白質酶解肽段進行TMT標記、液相分離和質譜鑒定。結果顯示,四次重復標記試驗共獲得1290個重復蛋白質,差異倍數≥2.0的重復差異蛋白304個,以性成熟期水牛睪丸曲精細管作為對照,其中只在性成熟前期水牛睪丸曲精細管中表達上調的蛋白有252個,下調16個；只在性成熟后期水牛睪丸曲精細管中表達上調的蛋白有1個,下調26個；在性成熟前期和性成熟后期均表達下調的蛋白有9個。其次,對三個時期水牛睪丸曲精細管差異蛋白質進行生物信息學分析。主要進行GO分析及信號通路分析,同時結合UniProU SpermatogenesisOnline 1.0等數據庫進行綜合檢索,發(fā)現(xiàn)27個與精子發(fā)生相關及26個與細胞生長發(fā)育、老化增殖相關的差異蛋白質。最后,從這些重要差異蛋白質中選取7個進行一系列驗證。對這7個蛋白(CABS1、HSPA2、EEF1G、AKAP3、ROPN1、 ODF2、SPERT)進行Western blot和實時熒光定量PCR驗證以及進一步的細胞定位分析。發(fā)現(xiàn)Western blot結果與TMT定量結果一致；HSPA2、EEF1G、AKAP3和SPERT在不同發(fā)育時期水牛睪丸曲精細管中的蛋白表達模式與mRNA表達模式一致；免疫組化分析結果發(fā)現(xiàn),EEF1G主要定位于圓形精子細胞核上,同時在支持細胞和間質細胞核中有少量表達,HSPA2在細胞質、精原細胞及曲精細管基膜上有表達,CABS1主要在精子細胞胞質中表達；對其余的四個蛋白進行精子的免疫熒光分析發(fā)現(xiàn),SPERT位于精子頂體、頸部和中段起始部分,AKAP3和ODF2主要位于精子頂體部分,ROPN1主要位于精子尾部主段。本章試驗采用TMT結合2D LC-MS/MS技術能夠對不同時期水牛睪丸曲精細管蛋白質進行有效地分離和鑒定,更加全面地展示水牛睪丸曲精細管在不同發(fā)育時期蛋白質的表達情況和變化規(guī)律。綜上所述,本研究分別采用雙向電泳和液相色譜技術對不同時期(性成熟前期、性成熟期、性成熟后期)水牛睪丸曲精細管蛋白質進行分離和質譜鑒定,首次建立了三個不同發(fā)育時期水牛睪丸曲精細管差異蛋白質表達譜。該研究結果將有助于闡明精子發(fā)生的分子機制,并找到可能與水牛精子發(fā)生相關的標志性蛋白,為后續(xù)水牛生殖調控的研究打下堅實基礎。
[Abstract]:In this study , the difference of protein expression in testis of buffalo was studied by means of two - dimensional electrophoresis and two - dimensional electrophoresis .
In the second chapter , we established the two - dimensional electrophoresis system of spermatic tubules of bovine testis in the late stage of sexual maturation . The results showed that there were a number of different proteins , such as superoxide dismutase , heat shock protein HSPA2 , wave form protein , anti - proliferative protein , cytokeratin KRT8 and galectin 1 . The results showed that there were only two hundred and twenty - two different protein subunits , including superoxide dismutase , heat shock protein HSPA2 , wave form protein , anti - proliferative protein , cytokeratins KRT8 , and galectin 1 .
There were 1 and 26 downregulated proteins in the spermatic tubules of buffalo testis only in the late stage of sexual maturation .
In the early and late stage of sexual maturation , there were 9 proteins down - regulated in the late stage and late stage of sexual maturation .
The protein expression pattern of HSPA2 , EEF1G , AKAP3 and SPERT was consistent with that of mRNA expression pattern during different developmental stages .
The results of immunohistochemistry showed that EEF1G was mainly located on the nucleus of circular sperm , and the expression of HSPA2 was expressed in the cytoplasm , spermatogonia and convoluted tubules , and CABS1 was mainly expressed in the cytoplasm of sperm cells .
In this chapter , two - dimensional electrophoresis and liquid chromatography ( LC - MS / MS ) technique was used to separate and identify the protein in the testis of buffalo testis . The results of this study could help clarify the molecular mechanism of the spermatids and find the marker proteins which may be related to the spermatids of buffalo .

【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S823.83
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本文編號：1702952