本文關(guān)鍵詞：副豬嗜血桿菌喹諾酮耐藥分子特征及豬鏈球菌多重耐藥機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《華中農(nóng)業(yè)大學》 2015年

副豬嗜血桿菌喹諾酮耐藥分子特征及豬鏈球菌多重耐藥機制研究

張強  

【摘要】：細菌耐藥性是細菌抵抗藥物殺傷或抑制作用的一種表型,是制約臨床細菌疾病預防和治療的一個重要因素。隨著抗菌藥物的研究與發(fā)展,其臨床應(yīng)用也越來越廣泛,甚至一些濫用現(xiàn)象也開始頻繁出現(xiàn),這都為細菌耐藥性的出現(xiàn)提供了有利條件。近年來,細菌的耐藥性問題越來越嚴峻(Aarestrup 2005),細菌的耐藥性正在朝著高耐藥率,多重耐藥的方向發(fā)展,已經(jīng)成為了一個嚴重的人類公共衛(wèi)生問題。副豬嗜血桿菌(HPS)和豬鏈球菌(SS)作為全球性的重要的豬傳染病病原,近年來隨著養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展,其耐藥情況也越來越嚴重,本論文對其耐藥機制分別進行了研究,主要的成果如下:1、副豬嗜血桿菌臨床分離菌株喹諾酮耐藥分子機制研究本研究中,以138株HPS臨床分離菌株為研究對象,首先利用E-test藥敏紙條分別檢測每株細菌對恩諾沙星和左旋氧氟沙星的MIC值,根據(jù)2008年頒布的CLSI標準,判定138株HPS的耐藥情況分別為:恩諾沙星的耐藥率為60.1%,左旋氧氟沙星的耐藥率為5.8%,并且左旋氧氟沙星的耐藥菌株對恩諾沙星均表現(xiàn)出了高水平的耐藥性。進一步,通過測序分析喹諾酮耐藥相關(guān)基因DNA解旋酶(Gyr A、Gyr B)和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ(Par C、Par E)的突變情況,結(jié)合各菌株的耐藥性,共發(fā)現(xiàn)了10個耐藥相關(guān)基因突變位點。其中,Gyr A87位點在所有恩諾沙星耐藥菌株中的突變率為100%,提示了Gyr A87位點的突變對HPS喹諾酮耐藥性形成的重要性;進一步分析發(fā)現(xiàn)Par C73位點的突變,能夠協(xié)助其它相關(guān)突變位點增強HPS對喹諾酮藥物的耐受性;甚至,本研究中還首次發(fā)現(xiàn)了Par E的耐藥相關(guān)突變位點(Par E551位點的突變)。為了更加直接的證明DNA解旋酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ的突變是引起HPS耐受恩諾沙星和左旋氧氟沙星的原因,本研究中,進行了定向點突變實驗,分別為:Gyr A(87D→N)、Par C(73S→R)、Par E(551T→A),結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3個位點的突變均能使細菌對恩諾沙星和左旋氧氟沙星的MIC值明顯升高,證明了DNA解旋酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ的突變確實是引起細菌耐受喹諾酮的重要原因。另外,本研究中繼續(xù)分析了HPS的假設(shè)毒力因子與其喹諾酮耐藥性之間的相關(guān)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPS的喹諾酮耐藥菌株較其敏感菌株,含有更多的假設(shè)毒力因子(hhd A、fim B和hsd R),表明在HPS中,喹諾酮耐藥性與其假設(shè)毒力因子之間存在正相關(guān)性,這一結(jié)果不同于以往的任何相關(guān)報道,這為該方面的研究提供了新的視野,使其更加全面和豐富。2、豬鏈球菌R61多重耐藥機制的研究R61是本實驗室前期工作中發(fā)現(xiàn)的一株“超級耐藥”豬鏈球菌,雖然通過比較基因組學分析部分解釋了其耐藥機制,但是卻并不完善,因此,本研究以R61為研究對象,繼續(xù)對其多重耐藥機制展開了研究。首先,將R61在不同條件下培養(yǎng)(分別添加阿莫西林、氯霉素、頭孢噻肟、紅霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素,無抗生素添加,以及同時添加上述6種抗生素),待其生長至對數(shù)中期時,分別提取其全菌蛋白。然后進一步通過雙向電泳分析藥物刺激后R61的差異表達蛋白,共46個(大于2倍),其中上調(diào)表達蛋白32個,下調(diào)表達蛋白14個,并分別對這些差異蛋白進行質(zhì)譜鑒定。為了進一步探索R61的耐藥機制,結(jié)合各蛋白的功能及特點,選取可能與耐藥性相關(guān)的13個蛋白(上調(diào)9個,下調(diào)4個),分別構(gòu)建其過表達菌株(上調(diào)蛋白構(gòu)建A7過表達菌株,下調(diào)蛋白構(gòu)建R61過表達菌株)并檢測其MIC值的變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):SSUR61_0413(β-內(nèi)酰胺水解酶)和SSUR61_2137(新陳代謝控制蛋白A)基因的上調(diào),以及SSUR61_1509(自溶素)的下調(diào),均能夠使細菌對藥物的MIC值明顯變化。另外,SSUR61_0927(甲基轉(zhuǎn)移酶)基因的上調(diào)也能夠使A7對紅霉素的耐藥性明顯提升。最終我們發(fā)現(xiàn),R61能夠通過誘導β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生、增強新陳代謝以及降低自溶素溶解,進而促進其多重耐藥性。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61
【目錄】：

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本文編號：167973