本文選題：北京鴨脾壞死病　切入點(diǎn)：鴨呼腸孤病毒　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：北京鴨“脾壞死病”是由鴨呼腸孤病毒(Duck reovirus, DRV)引起的一種病毒性疾病,以往該病所引起的死亡率較低,但在2013年,河南某鴨場所飼養(yǎng)的北京鴨發(fā)生該病,導(dǎo)致兩批雛鴨死亡60%左右。因此,本研究旨在對(duì)可能出現(xiàn)的DRV變異株進(jìn)行分子檢測、分離與鑒定,進(jìn)而對(duì)病毒分離株的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。用DRV特異性RT-PCR進(jìn)行檢測,從7份病死鴨脾臟樣品均可檢出DRV的μB、σB和σC蛋白編碼基因。經(jīng)病毒分離、培養(yǎng)和空斑純化,獲得兩株DRV克隆株(HN5d株和HN5c株)。對(duì)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序和序列分析的結(jié)果顯示,相對(duì)于以往所測DRV 091株,HN5d株的σC編碼區(qū)存在54 bp的連續(xù)缺失。用兩株病毒感染1日齡北京鴨,可導(dǎo)致20-40%的雛鴨死亡,并可復(fù)制出鴨“脾壞死病”的脾臟壞死病變,同時(shí),還可引起肝臟出血和壞死病變。組織病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)實(shí)驗(yàn)感染鴨的肝臟和脾臟病變。用免疫組化試驗(yàn)從實(shí)驗(yàn)感染鴨的肝臟和脾臟檢出大量棕黃色陽性信號(hào),用擴(kuò)增DRV S1基因的RT-PCR從死亡鴨的各組織樣品和存活鴨的肝臟和脾臟樣品中均易檢測到DRV核酸。結(jié)果表明,相對(duì)于以往的DRV 091株,HN5c株和HN5d株對(duì)雛鴨具有較高的致病性,屬于新的變異株。HN5c株感染引起的死亡率略高于HN5d株,表現(xiàn)出更高的致病性,但二者所引起的死亡率之間并無顯著性差異。在上述工作基礎(chǔ)上,觀察了兩株病毒的分子特征及σC基因缺失對(duì)病毒生物學(xué)特性的影響。SDS-PAGE結(jié)果顯示,兩株病毒的基因組均含10個(gè)基因片段。基因組測序和序列分析結(jié)果顯示,HN5c株和HN5d株與以往所測北京鴨源DRV 091株具有相近的遺傳演化關(guān)系,均屬水禽呼腸孤病毒的基因2型。基因組分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)HN5d株的σC蛋白存在18 aa的缺失。兩株病毒在Vero細(xì)胞中均表現(xiàn)出良好的增殖性能,但相對(duì)而言,HN5d株感染可產(chǎn)生更高的滴度。交叉中和試驗(yàn)結(jié)果顯示,HN5c株和HN5d株的抗原相關(guān)系數(shù)為56.2%。結(jié)果提示,HN5d株σC蛋白缺失的18 aa可能與病毒的復(fù)制能力有關(guān),并影響到病毒的抗原性。用肽掃描法進(jìn)行鑒定的結(jié)果表明,該18 aa序列至少含有1個(gè)3細(xì)胞線性表位,其缺失是導(dǎo)致兩株病毒出現(xiàn)抗原性差異的重要原因。用熒光定量RT-PCR% 和 Western blotting評(píng)估了感染細(xì)胞內(nèi)σC蛋白的表達(dá)量。結(jié)果顯示,HN5d株σC蛋白編碼基因的相對(duì)核酸表達(dá)量以及aC蛋白表達(dá)量均高于HN5c株。熒光／免疫熒光和免疫印跡結(jié)果顯示,用HN5c株和HN5d株的aC基因真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后,其σc蛋白均獲得表達(dá)；在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察,可見σc蛋白表達(dá)于細(xì)胞漿中。用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒對(duì)病毒感染和I真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Vero細(xì)胞進(jìn)行了檢測,結(jié)果表明,兩株DRV及其σC蛋白均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在病毒感染的細(xì)胞內(nèi),HN5d株誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力顯著強(qiáng)于HN5c株(P0.05)；在真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi),兩株病毒的σC蛋白所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡無顯著差異(P0.05)。結(jié)果表明,HN5d株的σC蛋白的18 aa缺失對(duì)DRV及其σC蛋白所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡程度無顯著影響。綜上所述,本研究從分子特征和生物學(xué)特性角度揭示了北京鴨源呼腸孤病毒的毒株多樣性,并證實(shí)所分離的DRV及其σC蛋白均可誘導(dǎo)Vero細(xì)胞凋亡。本研究有助于理解北京鴨“脾壞死病”及其病原特征,亦為鴨呼腸孤病毒的致病機(jī)理提供了數(shù)據(jù)。
[Abstract]:Beijing duck spleen necrosis disease "by duck reovirus (Duck reovirus DRV) is a viral disease caused by the past, the disease caused by the low mortality, but in 2013, the occurrence of the disease in Beijing Henan duck duck rearing sites, resulting in two batches of about 60%. So the death of ducklings. The purpose of this study is to conduct molecular detection of possible DRV mutation, isolation and identification, and study the biological characteristics of the virus isolates were detected by DRV. The specificity of RT-PCR detection, B DRV from 7 dead duck spleen samples can be B and sigma Sigma C protein encoding gene by virus isolation. Culture, and plaque purification, to obtain two DRV clones (HN5d strain and HN5c strain). The display of the RT-PCR amplified products were sequencing and sequence analysis results, compared with the previous measured DRV 091 strains, 54 continuous deletion of BP encoding region of sigma C HN5d strain. By two strains of virus infection 1 days Beijing duck, 20-40% can lead to the death of ducklings, and can replicate the duck spleen necrosis of spleen necrosis lesions, at the same time, can also cause liver necrosis and hemorrhage lesions. The histopathological findings further confirmed experimentally infected duck liver and spleen disease. Immunohistochemical test detected a large number of brown positive signal from the experimental infection of duck liver and spleen, were easily detected DRV nucleic acid of each tissue sample from the dead ducks with amplification of DRV S1 gene of RT-PCR and survival of duck liver and spleen samples. The results show that, compared with the previous DRV 091 strains of pathogenic HN5c strain and HN5d strain of duck is high, belong to the new the mutant strain.HN5c infection induced mortality was slightly higher than that of HN5d strain showed a higher pathogenicity, but not between the two caused by the mortality significantly. On the basis of the above work, the molecular observation of two strains The characteristics of C gene deletion and sigma effect on virus biological characteristics of.SDS-PAGE showed that two strains of the virus genome contains 10 genes. The genome sequencing and sequence analysis showed that HN5c and HN5d strains with the previous measured Beijing duck DRV 091 strains with similar genetic evolutionary relationship as Waterfowl reovirus genotype 2. Genome analysis results further confirmed the lack of HN5d strain C protein 18 sigma AA. Two strains of virus in Vero cells showed a proliferation of good performance, but relatively speaking, HN5d strains can produce higher titers. Cross and test results showed that HN5c strain and HN5d strain the correlation coefficient of 56.2%. antigen showed that HN5d strain C protein deletion of 18 sigma AA may be associated with virus replication, and affect the antigenicity identification by peptide scanning method. The results show that the aa sequence containing at least 18 1 3 cell linear epitopes, its deficiency is an important cause of the emergence of antigenic differences between two strains of the virus. Using fluorescence quantitative RT-PCR% and Western blotting were evaluated expression of sigma C protein in infected cells. The results showed that the amount and the amount of protein expression of aC was higher than that of HN5c strain HN5d strain. C relative nucleic acid protein encoding gene expression. Fluorescence and immunofluorescence and Western blot results showed that HN5c strain and HN5d strain aC gene eukaryotic expression plasmid was transfected into Vero cells, the expression of sigma C protein were obtained; in the observation of laser confocal fluorescence microscope, a visible expression of C protein in the cytoplasm. The virus infection and I plasmid the grain of Vero cells transfected with V-FITC/PI cell apoptosis by Annexin assay kit were detected, the results show that the two strains of DRV and sigma C protein could induce apoptosis in virus infected cells, HN5d strain can induce apoptosis The force was stronger than that of HN5c strain (P0.05); in eukaryotic plasmid transfected cells, no significant difference in apoptosis induced by two strains of the virus. C protein (P0.05). The results showed that no significant influence of HN5d cell apoptosis. C protein 18 AA deletion induced by DRV and C. Protein. In summary, this study from the perspective of molecular characteristics and biological characteristics reveal that the Beijing duck reovirus strains diversity, and confirmed by the separation of DRV and sigma C proteins can induce apoptosis in Vero cells. This study is helpful to understand the characteristics of the original "Beijing duck spleen necrosis disease and disease, provide the data for the pathogenic mechanism of duck reovirus.

【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.32

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本文編號(hào)：1638358