本文關(guān)鍵詞：內(nèi)蒙古地區(qū)牛源致病鏈球菌的耐藥性、毒力特征分析及其兩者的相關(guān)性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2015年

內(nèi)蒙古地區(qū)牛源致病鏈球菌的耐藥性、毒力特征分析及其兩者的相關(guān)性研究

丁月霞  

【摘要】：奶牛養(yǎng)殖業(yè)中常見的奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生能降低奶牛產(chǎn)奶量和牛奶品質(zhì),也可導(dǎo)致奶牛繁殖能力下降甚至影響受胎率。內(nèi)蒙古是我國主要的畜牧業(yè)生產(chǎn)基地之一,但這些常見疾病的發(fā)生給畜牧業(yè)發(fā)展帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。細(xì)菌感染是引發(fā)臨床牛源性疾病的重要因素,牛源鏈球菌是引發(fā)奶牛細(xì)菌性疾病的主要病原菌之一,其所含的致病因子與奶牛炎癥的發(fā)生與流行有關(guān)。臨床中常采用抗菌藥物治療奶牛疾病,長期使用這些抗菌藥物,并且普遍存在抗菌藥物的不合理使用現(xiàn)象,這致使牛源致病鏈球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性逐漸增加。因而,開展牛源致病鏈球菌臨床常用抗菌藥物的耐藥性研究,并對(duì)其耐藥機(jī)理的深入了解,這對(duì)奶牛鏈球菌病的防控具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究通過開展內(nèi)蒙古地區(qū)牛源致病鏈球菌及其毒力基因在各菌種間的分布情況調(diào)查,探討鏈球菌在引發(fā)奶牛細(xì)菌性疾病發(fā)生過程及傳播途徑中存在的致病作用；同時(shí),開展臨床中分離的牛源鏈球菌對(duì)獸醫(yī)臨床常用藥物的耐藥性及其機(jī)制的研究,可為內(nèi)蒙古地區(qū)牛源致病鏈球菌耐藥性產(chǎn)生的原因,以及臨床中對(duì)該菌屬細(xì)菌的防控提供了詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)與合理的用藥方案；在此基礎(chǔ)上,通過開展敏感鏈球菌體外誘導(dǎo)耐藥及耐藥質(zhì)粒接合試驗(yàn)研究,進(jìn)一步分析該地區(qū)牛源致病鏈球菌耐藥性與毒力特征之間的關(guān)系,闡明內(nèi)蒙古地區(qū)牛源致病鏈球菌耐藥性發(fā)生的變化是否與其毒力特征存在相關(guān)性,以期為牛源致病鏈球菌耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及控制或減少由該菌屬細(xì)菌感染的奶牛疾病奠定理論基礎(chǔ)。(1)對(duì)內(nèi)蒙古不同地區(qū)臨床中奶牛乳房炎及子宮內(nèi)膜炎的360份病料,采用微生物分離鑒定的方法,應(yīng)用sodA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對(duì)疑似鏈球菌進(jìn)行了分離及分子水平鑒定。該試驗(yàn)結(jié)果顯示,從內(nèi)蒙古不同地區(qū)采集的360份病料中,共分離鑒定到116株牛源鏈球菌,總體分離率達(dá)到32.2%。其中分離到無乳鏈球菌(S.agalactiae)78株(67.2%),停乳鏈球菌(S. dysgalactiae) 21株(18.1%)以及乳房鏈球菌(S. uberis)17株(14.7%)。各地區(qū)鏈球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌及乳房鏈球菌的分離率差異均不顯著(P0.05)。(2)采用PCR法對(duì)臨床分離鏈球菌的8種常見毒力基因進(jìn)行調(diào)查。該部分試驗(yàn)結(jié)果顯示,bac基因編碼的p-抗原在所有分離菌株中均未檢測(cè)到,其余7種毒力基因廣泛分布于鏈球菌屬的各個(gè)菌種間。其中編碼p-溶血素的cyl基因檢出數(shù)最多(58株/50.0%),其次為hylB(56株/48.3%),glnA(52株/44.8%)以及cfb(51株/44.0%)基因。同時(shí)發(fā)現(xiàn)15種不同的毒力基因組合,攜帶cyl+hylB+cfb+glnA基因型的菌株最為流行(34株/29.3%)。(3)采用CLSI推薦的微量肉湯稀釋法,測(cè)定23種獸醫(yī)臨床常用于治療奶牛疾病的抗菌藥物對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)臨床分離鏈球菌的最小抑菌濃度。該部分試驗(yàn)結(jié)果表明,分離鏈球菌在對(duì)23種抗菌藥物的敏感性檢測(cè)中,對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率最高,耐藥率在80.3%～96.6%之間；對(duì)四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥率在42%-85%之間；對(duì)克林霉素耐藥率(60%以上)也偏高；對(duì)氟喹諾酮類、氯霉素和萬古霉素相對(duì)敏感,其中左氧氟沙星耐藥率僅2.6%。116株內(nèi)蒙古地區(qū)牛源致病鏈球菌中共發(fā)現(xiàn)有102株多重耐藥菌(87.9%)。采用PCR法對(duì)p-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類及大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥菌株進(jìn)行了分子機(jī)制調(diào)查。試驗(yàn)結(jié)果顯示,該地區(qū)p-內(nèi)酰胺類耐藥菌株產(chǎn)生的主要分子機(jī)制是青霉素結(jié)合蛋白變異(PBPs)所致；四環(huán)素類耐藥菌株的耐藥機(jī)制是由tetL介導(dǎo)的外排機(jī)制與tetM基因介導(dǎo)核糖體保護(hù)兩種分子機(jī)制貢獻(xiàn)；大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株的耐藥機(jī)制是由ermB基因介導(dǎo)的核糖體甲基化。(4)采取體外逐漸增加藥物濃度的方法誘導(dǎo)肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株A TCC49619及臨床分離紅霉素敏感菌株耐藥。試驗(yàn)結(jié)果表明,肺炎鏈球菌ATCC49619及15株臨床分離敏感菌在誘導(dǎo)10代和12代時(shí)產(chǎn)生高耐性,MIC≥64μg/mL,耐藥子代在無藥培養(yǎng)基中傳代5次,MIC未發(fā)生改變,表明誘導(dǎo)耐藥株耐藥性穩(wěn)定。誘導(dǎo)耐藥菌株經(jīng)PCR檢測(cè),93.8%檢測(cè)到ermB基因,表明誘導(dǎo)耐藥的分子機(jī)制主要與抗生素結(jié)合的核糖體靶位發(fā)生甲基化有關(guān)。(5)采用濾膜結(jié)合法開展質(zhì)粒接合試驗(yàn)。供體菌為臨床分離高耐四環(huán)素的鏈球菌20株,受體菌為誘導(dǎo)耐藥后的肺炎鏈球菌ATCC49619-ERY.質(zhì)粒接合試驗(yàn)表明,四環(huán)素的高耐性可以傳遞到肺炎鏈球菌ATCC49619-ERY,每一菌種之間轉(zhuǎn)移率達(dá)100%：接合子獲得了供體菌的耐藥表型及相關(guān)耐藥基因。(6)選擇誘導(dǎo)耐藥和質(zhì)粒接合的部分菌株,經(jīng)過耐藥性及毒力基因篩選,通過對(duì)小鼠LDso的測(cè)定,分析鏈球菌耐藥性與毒力特征的相關(guān)性。試驗(yàn)結(jié)果顯示,誘導(dǎo)耐藥組中青霉素誘導(dǎo)耐藥的停乳鏈球菌CVCC3701-PEN與親本株比較,LD50值比誘導(dǎo)前升高了1.1×102倍；質(zhì)粒接合組中接合子的LD5o與受體菌比較升高了1.6倍,表明敏感菌在獲得耐藥性后毒力均有所下降。本研究得到的主要結(jié)論如下：(1)鏈球菌屬細(xì)菌的各個(gè)菌種在內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎的病原菌中分布廣泛,其中無乳鏈球菌是所有分離鏈球菌的優(yōu)勢(shì)菌種。(2)多種毒力因子廣泛的分布于內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎的鏈球菌中,有60.3%的牛源鏈球菌至少攜帶一種毒力因子,且毒力基因型復(fù)雜。(3)內(nèi)蒙古地區(qū)分離的牛源鏈球菌對(duì)獸醫(yī)臨床常用抗菌藥物產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性,這可能是導(dǎo)致該地區(qū)奶牛乳房炎及子宮內(nèi)膜炎頻發(fā)及抗菌藥療效不理想的主要原因之一。(4)內(nèi)蒙古地區(qū)分離的紅霉素敏感鏈球菌及肺炎鏈球菌ATCC49619經(jīng)紅霉素體外誘導(dǎo)耐藥,MIC值由≤0.5μg/mL上升至μg/mL,且均攜帶ermB或mefA耐藥基因。(5)內(nèi)蒙古地區(qū)分離的高耐四環(huán)素鏈球菌經(jīng)質(zhì)粒接合試驗(yàn)可將其耐藥性轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移率達(dá)100%；接合子獲得了供體菌的耐藥表型及相關(guān)耐藥基因。(6)質(zhì)粒接合中的接合子的LD50與受體菌比較,青霉素誘導(dǎo)耐藥的停乳鏈球菌CVCC3701-PEN與親本株LD50比較,敏感菌在獲得耐藥性后毒力均有不同程度降低。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

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【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：內(nèi)蒙古地區(qū)牛源致病鏈球菌的耐藥性、毒力特征分析及其兩者的相關(guān)性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：160726