本文選題：狂犬病病毒　切入點：memantine　出處：《華中農業(yè)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus,RABV)感染動物神經系統(tǒng)導致神經活動紊亂的一種人畜共患病,致死率高達100%�？袢≡谌蚍秶鷥确植紡V泛,當前對狂犬病的防控仍不徹底,每年依然有上萬例狂犬病患者死亡。目前針對狂犬病防控和治療的研究主要集中在RABV的疫苗研發(fā)、田間防疫、發(fā)病機理以及藥物控制等方面,但對狂犬病的治療仍然沒有有效的藥物和方法。由于狂犬病病毒侵染神經系統(tǒng)導致神經系統(tǒng)的功能紊亂,短時間內嚴重威脅患者的生命,為了緩解狂犬病毒引起的神經紊亂并為機體免疫系統(tǒng)贏得抵抗狂犬病病毒的寶貴時間,我們利用目前對神經具有保護作用的藥物-美金胺(memantine)來開展該藥物在緩解狂犬病癥狀方面的研究,以期為狂犬病的臨床治療提供新的思路和方法。另一方面,由于RABV對神經系統(tǒng)的高度嗜性,是目前最為常用的高效逆行環(huán)路示蹤病毒之一�；赗ABV開發(fā)更為有效的環(huán)路示蹤工具將有助于神經環(huán)路結構與功能的研究。因此,我們在已有的RABV反向遺傳學系統(tǒng)的基礎上對病毒基因組做出改造和修飾,拯救出了有標記和操控功能的且傳播缺陷的糖蛋白缺失重組病毒(rRABVΔG),并且用于解析視覺神經環(huán)路的精細結構和功能。具體研究內容如下:1.Memantine緩解狂犬病癥狀的研究藥物memantine能夠通過血腦屏障,對神經元表面N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA受體)非競爭性可逆結合,對神經元具有保護作用,用于治療阿爾茨海默癥。為了探索該藥物能否緩解狂犬病毒造成的神經活動紊亂,我們開展了如下實驗:(1)將RABV中強毒株CVS-24感染體外培養(yǎng)的原代神經元,加入memantine后發(fā)現(xiàn)其對RABV引起的神經元損傷有一定的保護作用;(2)在小鼠的RABV攻毒實驗中,memantine對發(fā)病小鼠的治療作用有限,能微弱地延長發(fā)病小鼠生存時間。作為對比,在日本乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)感染的小鼠實驗中,memantine能顯著延長小鼠生存時間、降低腦內血管袖套和炎性細胞浸潤,對小鼠腦內病毒量也有降低作用。2.利用狂犬示蹤病毒(rRABVΔG)解析初級視覺皮層至丘腦環(huán)路的精細結構通過反向遺傳學操作系統(tǒng)改造rRABV-SAD,敲除糖蛋白(glycoprotein,G)基因并插入多種顏色的熒光蛋白基因,得到多色狂犬示蹤病毒。將該病毒注射到小鼠丘腦背外側核(lateraldorsal of thalamus nucleus,LD)、丘腦后外側核(lateralposterior of thalamus nudleus,LP)和外側膝狀體背側核(dorsal part of lateral geniculate nucleus,d LGN)等初級視覺皮層(primary cisual cortex,V1)的投射靶區(qū),逆行標記靶向該區(qū)的V1皮層神經元,通過熒光顏色將靶向丘腦特定核團的V1神經元分群,并分析了它們的分布特點;同時我們觀察到一些同時投射到丘腦的多個核團的V1皮層神經元即多靶神經元,進一步結合熒光顯微光學切片斷層成像技術(fluorescence micro-optical sectioning tomography,fMOST),我們對單細胞水平的V1皮層多靶神經元進行了全腦精細成像;為了進一步追蹤靶向丘腦特點核團的V1神經元的上游環(huán)路,我們在V1皮層感染AAV病毒補充狂犬病毒的G蛋白,使V1神經元內的rRABVΔG逆行跨單級突觸標記上游神經元,從而解析了V1-LD、V1-LP和V1-d LGN環(huán)路的上游環(huán)路,進而對上游神經元的分布和數量進行全腦范圍內統(tǒng)計分析,最終得到全面而詳細的V1至丘腦環(huán)路的精細結構。3.利用改造的嗜神經病毒初步探索V1至丘腦環(huán)路的功能結合rRABVΔG病毒示蹤技術和在體雙光子鈣成像技術,我們對V1-丘腦核團的環(huán)路進行功能上的探索,主要在樹突棘和樹突水平分析了靶向丘腦不同核團的V1神經元的自發(fā)神經活動特點,從而對比V1-丘腦特定核團投射環(huán)路中V1神經元接收上游環(huán)路的輸入的差異。4.單眼視覺剝奪的病理模型中V1至丘腦環(huán)路的結構可塑性在單眼視覺剝奪(monocular deprivation,MD)模型下,結合rRABVΔG病毒示蹤、光遺傳學和在體光纖記錄手段探索V1-丘腦環(huán)路的可塑性。通過rRABVΔG-eGFP病毒對MD小鼠對側丘腦核團逆行標記,發(fā)現(xiàn)逆標的V1神經元數量與對照相比顯著減少,提示在視覺形成關鍵期對小鼠單眼視覺剝奪能夠引起V1-丘腦投射的減少;進一步通過光遺傳學手段刺激V1的神經元,通過光纖檢測鈣信號技術記錄丘腦相關核團神經活動,最終在活體水平對環(huán)路的可塑性變化進行功能性驗證。我們在memantine緩解狂犬病方面的研究對狂犬病治療方法的探索有參考意義。同時,我們在利用狂犬病毒示蹤工具解析初級視覺皮層至丘腦環(huán)路的精細結構與可塑性的研究,將為視覺功能研究提供一定的環(huán)路基礎,有助于解析視覺信息在皮層與丘腦間的傳遞與整合,也將有助于補充人們對視覺環(huán)路可塑性的認識。
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【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S855.3

【參考文獻】

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本文編號：1591850