本文關(guān)鍵詞： 杏候選基因 比較轉(zhuǎn)錄組 內(nèi)果皮發(fā)育及木質(zhì)化 苯丙烷途徑　出處：《沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：杏(Prunus.armeniaca L.)是薔薇科(Rosaceae)家族中典型的核果類果樹,其內(nèi)果皮的高度木質(zhì)化是果實(shí)成熟的重要標(biāo)志之一。中國具有豐富的杏種質(zhì)資源,其中許多品種具有很高的育種價(jià)值。裂核杏('Liehe',LE apricot)原產(chǎn)于遼寧省凌源市,是非常稀有的栽培品種,其內(nèi)果皮薄、組織較軟且伴有開裂現(xiàn)象,部分種子外露。裂核杏內(nèi)果皮的厚度僅為錦西紅杏(內(nèi)果皮發(fā)育正常)的60.39%。本研究以裂核杏為主要試材,利用物候期相同、起源地相近的錦西紅杏為對(duì)照,研究了杏果實(shí)發(fā)育四個(gè)物候期的劃分,觀察了杏內(nèi)果皮早期發(fā)育及木質(zhì)素沉積過程,借助轉(zhuǎn)錄組測序挖掘與杏內(nèi)果皮發(fā)育及木質(zhì)素沉積相關(guān)的差異基因,分析了差異基因在果實(shí)發(fā)育期間的表達(dá)水平,克隆了重要差異基因CAD、NST1,并通過不同品種仁用杏加以驗(yàn)證,以期探討裂核杏內(nèi)果皮發(fā)育的內(nèi)在機(jī)制。主要研究內(nèi)容如下:1.利用Pearl-Reed logistic模型擬合裂核杏與錦西紅杏的生長曲線并求出一階導(dǎo)數(shù),結(jié)合ACO1和PEPCK基因的表達(dá)水平將兩種杏果實(shí)發(fā)育劃分為四個(gè)相同的時(shí)期(S1-S4)。兩種杏內(nèi)果皮發(fā)育進(jìn)程相似,木質(zhì)素沉積過程需要25 d左右�；ê�15 d,裂核杏內(nèi)果皮開始出現(xiàn)開裂。通過Klason法測定內(nèi)果皮中木質(zhì)素的含量、差重法測定內(nèi)果皮中纖維素和半纖維素的含量,結(jié)果顯示:內(nèi)果皮的厚度與木質(zhì)素含量呈極顯著正相關(guān),且裂核杏的內(nèi)果皮厚度顯著薄于錦西紅杏�；ê�42 d,裂核杏內(nèi)果皮的脆性、硬度、內(nèi)聚性與粘著性分別是錦西紅杏的1.13、0.46、0.73與5.27倍,差異顯著。2.對(duì)花后15 d和花后21 d裂核杏與錦西紅杏果實(shí)進(jìn)行高通量測序,共獲得40.15 Gb原始數(shù)據(jù),Denovo組裝后一共獲得63,170條基因,其中25,123條基因被NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫注釋。表達(dá)模式分析一共獲得5385條差異基因。富集分析發(fā)現(xiàn),苯丙氨酸代謝、苯丙烷生物合成途徑影響顯著,且其中包含共34個(gè)與苯丙烷途徑相關(guān)的差異基因。通過差異基因的挖掘和實(shí)時(shí)熒光定量的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),花后15d,C4D(c10104.c0)在裂核杏果實(shí)中的表達(dá)比錦西紅杏低4.56倍;花后21 d表達(dá)量低了 5.52倍,差異非常顯著。裂核杏果實(shí)中C4D表達(dá)量與內(nèi)果皮厚度之間存在顯著相關(guān)(5%)。3.利用同源克隆法分別從裂核杏與錦西紅杏中獲得CAD與NST1序列。裂核杏與錦西紅杏NST1兩條片段的長度均為1187 bp,各編碼395個(gè)氨基酸,存在2個(gè)差異氨基酸。裂核杏與錦西紅杏差異氨基酸位點(diǎn)位于motif 3和motif 6。裂核杏這兩個(gè)氨基酸(A、L)出現(xiàn)概率非常小。CAD兩條片段長度均為1092 bp,各編碼363個(gè)氨基酸,存在5個(gè)差異氨基酸,其中裂核杏位于122 aa及127 aa的卷曲之間存在橫跨3個(gè)aa的β-折疊,而錦西紅杏的β-折疊橫跨2個(gè)aa。裂核杏位于294 aa的αα-螺旋之后存在橫跨5個(gè)aa的β-折疊,而錦西紅杏β-折疊橫跨3個(gè)aa。4.利用酶聯(lián)免疫法測定了果實(shí)S1、S2發(fā)育期間肉桂醇脫氫酶活性的動(dòng)態(tài)變化,在木質(zhì)素大量沉積的S2時(shí)期(30～49 d),錦西紅杏的CAD活性持續(xù)上升,裂核杏CAD活性先小幅度升高后不斷降低,裂核杏與錦西紅杏CAD的表達(dá)量與其內(nèi)果皮厚度分別呈5%和1%水平的顯著相關(guān)性,且裂核杏肉桂醇脫氫酶活性與內(nèi)果皮厚度呈1%水平極顯著相關(guān)性。裂核杏與錦西紅杏不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)中CAD及NST1的表達(dá)水平存在差異。錦西紅杏果實(shí)中CAD的表達(dá)均顯著高于裂核杏。裂核杏果實(shí)中NST1的表達(dá)量除了花后33 d(S2時(shí)期)外,其余時(shí)期均顯著低于錦西紅杏。5.利用試劑盒測定裂核杏與錦西紅杏果實(shí)漆酶(LAC)、過氧化物酶(POX)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,同時(shí)分析LAC4、PER2、PAL表達(dá)水平。S1期間,LAC4、PER72的表達(dá)水平及LAC、POX活性一般表現(xiàn)為裂核杏低于錦西紅杏,PAL的表達(dá)水平及PAL活性為裂核杏高于錦西紅杏。裂核杏中內(nèi)果皮木質(zhì)素含量的變化與LAC活性顯著正相關(guān)(5%),與POX的活性呈顯著負(fù)相關(guān)(5%);錦西紅杏中內(nèi)果皮木質(zhì)素含量的變化與LAC活性也呈顯著正相關(guān)(5%)。6.不同品種仁用杏之間內(nèi)果皮的厚度差異非常顯著,內(nèi)果皮相關(guān)10個(gè)因素測定數(shù)據(jù)用SPSS進(jìn)行主成分分析,第1主成分貢獻(xiàn)率最高,達(dá)到38.69%,主要以內(nèi)果皮厚度、內(nèi)果皮干重、肉桂醇脫氫酶(CAD)活性及漆酶(LAC)活性影響為主。前5個(gè)主成分積累貢獻(xiàn)率達(dá)94.78%。主成分得分綜合排名為(從高到底):龍王帽、錦西紅杏、裂核杏后代、白玉扁、一窩蜂、圍選1號(hào)、裂核杏、優(yōu)一。內(nèi)果皮從厚到薄的排序?yàn)榘子癖�、錦西紅杏、龍王帽、一窩蜂、裂核杏后代、裂核杏、圍選1號(hào)、裂核杏、優(yōu)一。主成分排序與實(shí)際測量值之間排序的規(guī)律非常相似,能明顯區(qū)分出內(nèi)果皮厚、薄的杏品種。綜合以上結(jié)果研究發(fā)現(xiàn),裂核杏內(nèi)果皮與錦西紅杏存在巨大差異的主要原因是裂核杏內(nèi)果皮質(zhì)地過脆,核肉黏連緊密,木質(zhì)素沉積較少所導(dǎo)致。而CAD及NST1可能與該差異有重要的聯(lián)系。
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【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S662.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉堰s，

本文編號(hào)：1555590