本文關(guān)鍵詞： 小鼠卵母細(xì)胞 精子 早期胚胎 DNA去甲基化 玻璃化冷凍　出處：《中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：本研究旨在探討小鼠配子(精子和卵母細(xì)胞)的冷凍保存對(duì)于體外受精后早期胚胎發(fā)育期間DNA甲基化模式的影響。首先,新鮮和冷凍精子受精后合子的原核發(fā)育和早期胚胎的發(fā)育過(guò)程監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示,冷凍精子的受精率顯著低于新鮮精子(P0.01)且原核發(fā)育的進(jìn)程明顯延遲(P0.05),獲得早期胚胎的卵裂率和囊胚形成率也顯著下降(P0.05)。各階段合子的全基因組甲基化水平檢測(cè)結(jié)果顯示,冷凍精子獲得的合子在發(fā)育晚期DNA相對(duì)甲基化水平顯著高于新鮮精子(P0.05)。此外,Tet3的mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果表明,冷凍精子獲得的合子中Tet3的mRNA相對(duì)表達(dá)量比新鮮精子有顯著的降低(P0.01)。其次,實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光染色對(duì)新鮮和玻璃化冷凍卵母細(xì)胞及其早期胚胎中三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)與分布檢測(cè)發(fā)現(xiàn),冷凍卵母細(xì)胞及其早期胚胎中三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶均出現(xiàn)了不同程度的表達(dá)異常。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)顯示,在冷凍卵母細(xì)胞中三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著下降,而在囊胚階段Dnmt3b的相對(duì)表達(dá)量仍然很低(P0.05)。最后,實(shí)驗(yàn)采用重亞硫酸鹽測(cè)序?qū)π迈r和玻璃化冷凍卵母細(xì)胞及其早期胚胎中四個(gè)與DNA去甲基化相關(guān)的重要基因Dnmtl、Tet3、Dppa3和Sall4的啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè),并使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)四個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。其中,玻璃化組在卵母細(xì)胞、合子、2-細(xì)胞和囊胚階段的Tet3啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平都比新鮮組上升了10%以上,高甲基化克隆的比例在卵母細(xì)胞和囊胚階段也均比新鮮組有顯著的升高(P0.05)。相應(yīng)地,玻璃化組在卵母細(xì)胞和早期胚胎中Tet3的mRNA相對(duì)表達(dá)量都出現(xiàn)了顯著的下降(P0.05)。玻璃化組在卵母細(xì)胞階段的Dnmtl啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平比新鮮組降低了10%以上,但在早期胚胎中僅出現(xiàn)了小幅變化。與之不同,玻璃化組在卵母細(xì)胞中Dnmt1的mRNA相對(duì)表達(dá)量也呈顯著下降(P0.05),但在早期胚胎階段與新鮮組無(wú)顯著差異。此外,兩組間Dppa3和Sal4的啟動(dòng)子區(qū)始終維持低甲基化狀態(tài),mRNA相對(duì)表達(dá)量也未受到玻璃化冷凍的影響。綜上所述,精子冷凍干擾了合子父源基因組內(nèi)TET3調(diào)控的DNA去甲基化進(jìn)程,從而導(dǎo)致了受精后合子的原核發(fā)育延遲,這會(huì)對(duì)隨后的早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生不利影響。而玻璃化冷凍會(huì)引起卵母細(xì)胞中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)模式的異常,這可能是導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育過(guò)程中DNA甲基化異常的重要原因之一。而卵母細(xì)胞玻璃化冷凍引起的合子期DNA去甲基化異�？赡苤饕怯蒚et3和Dnmt1啟動(dòng)子區(qū)甲基化異常和隨后的mRNA表達(dá)受損導(dǎo)致的。
[Abstract]:The results showed that the relative expression of Tet3 mRNA in frozen oocytes was significantly lower than that in fresh sperm ( P0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S814.8

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Epigenetic reprogramming of embryos derived from sperm frozen at-20℃[J];Science China(Life Sciences);2012年04期

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本文編號(hào)：1535933