本文關鍵詞： 小鼠卵母細胞 精子 早期胚胎 DNA去甲基化 玻璃化冷凍　出處：《中國農業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：本研究旨在探討小鼠配子(精子和卵母細胞)的冷凍保存對于體外受精后早期胚胎發(fā)育期間DNA甲基化模式的影響。首先,新鮮和冷凍精子受精后合子的原核發(fā)育和早期胚胎的發(fā)育過程監(jiān)測結果顯示,冷凍精子的受精率顯著低于新鮮精子(P0.01)且原核發(fā)育的進程明顯延遲(P0.05),獲得早期胚胎的卵裂率和囊胚形成率也顯著下降(P0.05)。各階段合子的全基因組甲基化水平檢測結果顯示,冷凍精子獲得的合子在發(fā)育晚期DNA相對甲基化水平顯著高于新鮮精子(P0.05)。此外,Tet3的mRNA相對表達量檢測結果表明,冷凍精子獲得的合子中Tet3的mRNA相對表達量比新鮮精子有顯著的降低(P0.01)。其次,實驗采用免疫熒光染色對新鮮和玻璃化冷凍卵母細胞及其早期胚胎中三種DNA甲基轉移酶的表達與分布檢測發(fā)現(xiàn),冷凍卵母細胞及其早期胚胎中三種DNA甲基轉移酶均出現(xiàn)了不同程度的表達異常。采用實時熒光定量PCR對三種DNA甲基轉移酶的mRNA表達水平檢測顯示,在冷凍卵母細胞中三種DNA甲基轉移酶的mRNA相對表達量均顯著下降,而在囊胚階段Dnmt3b的相對表達量仍然很低(P0.05)。最后,實驗采用重亞硫酸鹽測序對新鮮和玻璃化冷凍卵母細胞及其早期胚胎中四個與DNA去甲基化相關的重要基因Dnmtl、Tet3、Dppa3和Sall4的啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)進行檢測,并使用實時熒光定量PCR對四個基因的mRNA表達水平進行檢測。其中,玻璃化組在卵母細胞、合子、2-細胞和囊胚階段的Tet3啟動子區(qū)甲基化水平都比新鮮組上升了10%以上,高甲基化克隆的比例在卵母細胞和囊胚階段也均比新鮮組有顯著的升高(P0.05)。相應地,玻璃化組在卵母細胞和早期胚胎中Tet3的mRNA相對表達量都出現(xiàn)了顯著的下降(P0.05)。玻璃化組在卵母細胞階段的Dnmtl啟動子區(qū)甲基化水平比新鮮組降低了10%以上,但在早期胚胎中僅出現(xiàn)了小幅變化。與之不同,玻璃化組在卵母細胞中Dnmt1的mRNA相對表達量也呈顯著下降(P0.05),但在早期胚胎階段與新鮮組無顯著差異。此外,兩組間Dppa3和Sal4的啟動子區(qū)始終維持低甲基化狀態(tài),mRNA相對表達量也未受到玻璃化冷凍的影響。綜上所述,精子冷凍干擾了合子父源基因組內TET3調控的DNA去甲基化進程,從而導致了受精后合子的原核發(fā)育延遲,這會對隨后的早期胚胎發(fā)育產生不利影響。而玻璃化冷凍會引起卵母細胞中DNA甲基轉移酶表達模式的異常,這可能是導致早期胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化異常的重要原因之一。而卵母細胞玻璃化冷凍引起的合子期DNA去甲基化異�？赡苤饕怯蒚et3和Dnmt1啟動子區(qū)甲基化異常和隨后的mRNA表達受損導致的。
[Abstract]:The results showed that the relative expression of Tet3 mRNA in frozen oocytes was significantly lower than that in fresh sperm ( P0.05 ) .

【學位授予單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S814.8

【參考文獻】

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1 ;Epigenetic reprogramming of embryos derived from sperm frozen at-20℃[J];Science China(Life Sciences);2012年04期

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本文編號：1535933