本文關(guān)鍵詞： 3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1 蛋白激酶B 小泛素樣蛋白 Ⅲ型磷酸肌醇3-激酶　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1,PDPK1orPDK1)屬于AGC蛋白激酶家族(cAMP和cGMP依賴性的蛋白激酶C)的一員,它能磷酸化下游的許多蛋白,如Akt、p90RSK、p70S6K、SGK和PKC等。因此PDK1的活性對下游激酶以及各細胞功能有著重要的影響,但是病毒感染是否影響PDK1的活性,尚不可知。為了解病毒感染是如何影響PDK1的活性,我們檢測了不同病毒感染刺激對PDK1活性的影響。發(fā)現(xiàn)禽流感病毒、禽雙RNA病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬偽狂犬病毒分別感染293T,293T/DF-1和PK-15細胞,均能誘導(dǎo)一條分子量為210kDa左右的PDK1修飾條帶,進一步的實驗證實,此條帶為SUMO化修飾的PDK1。過表達FLAGPDK1和HASUMO1后,感染IBDV,并于感染后1、3、6、12h收樣進行IP,通過FLAG抗體來釣,并用抗HA抗體來檢測,可以在210KD左右的位置檢測到條帶,進一步證明PDK1的SUMO化修飾。通過網(wǎng)站預(yù)測到PDK1的SUMO化修飾位點分別為第207位、第296位和第495位賴氨酸,將這三個位點的賴氨酸同時突變?yōu)榫彼岷?PDK1的SUMO化修飾水平大大下降。同時還發(fā)現(xiàn)PDK1點突變后能夠抑制下游AKT和S6K的磷酸化。此外,轉(zhuǎn)染VP3的細胞中,AKT和S6K的磷酸化水平均明顯上調(diào)。因此,本研究內(nèi)容顯示,病毒感染能夠誘導(dǎo)PDK1的SUMO化修飾,并且PDK1的SUMO化修飾對下游AKT和S6K的磷酸化活性有著重要的影響。既然PDK1的SUMO化修飾在胞內(nèi)有著重要的作用,那么胞內(nèi)調(diào)控PDK1 SUMO化的機制就尤為重要。用PDK1作為誘餌蛋白來釣取胞內(nèi)蛋白,發(fā)現(xiàn)PDK1能釣下110KD左右的條帶,經(jīng)過質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)這個條帶為VPS34。我們采用CO-IP技術(shù)和PULL DOWN技術(shù)驗證了 PDK1和VPS34的互作為直接互作。進一步實驗證明過表達VPS34能夠抑制PDK1的SUMO1修飾。同時我們發(fā)現(xiàn)VPS34能夠破壞PDK1與UBC9的互作,從而抑制UBC9催化PDK1的SUMO化修飾。因此,研究表明VPS34能夠負調(diào)控PDK1的SUMO化修飾。SUMO化對于PDK1蛋白功能的發(fā)揮具有重要作用,但是PDK1的SUMO化修飾對于調(diào)控其底物AKT活性的機制目前尚不清楚。超高分辨結(jié)果顯示,PDK1的SUMO化修飾能夠促進PDK1轉(zhuǎn)移至膜周,并且和AKT定位在一塊。免疫共沉淀結(jié)果進一步確認(rèn)了 SUMO化能夠促進PDK1和AKT的互作。而PDK1和AKT的互作對于AKT的磷酸化是必須的。另外,研究表明IBDV通過VP3與VPS34互作,從而破壞了 VPS34和PDK1的互作,并因此促進了 PDK1的SUMO化。對VP3的功能域進行分析,發(fā)現(xiàn)VP3通過CC3結(jié)構(gòu)域與VPS34發(fā)生互作。而VP3通過CC1結(jié)構(gòu)域與Beclin-1發(fā)生互作。但是VP3是通過CC3來調(diào)節(jié)PDK1修飾條帶和AKT的活性。因此可以判定VP3是通過VPS34,而非Beclin-1來調(diào)節(jié)AKT的活性。同時研究還表明,VP3是通過AKT通路而非Beclin-1來抑制細胞自噬的。因此本章研究表明病毒感染可通過VPS34和PDK1的互作來調(diào)節(jié)PDK1的SUMO化狀態(tài),并進一步調(diào)節(jié)AKT的活性,從而調(diào)控病毒的感染。
[Abstract]:3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 (PDPK1 or PDK1) is a member of the AGC protein kinase family, camp and cGMP dependent protein kinase C, which phosphorylates many proteins downstream. Therefore, the activity of PDK1 has an important effect on downstream kinase and cell function, but whether virus infection affects the activity of PDK1 is not known. In order to understand how viral infection affects the activity of PDK1, We examined the effects of different viral stimuli on PDK1 activity. We found that avian influenza virus, avian double RNA virus, porcine circovirus type 2 and porcine pseudorabies virus were infected with 293Tm23T / DF-1 and PK-15 cells, respectively. All of them could induce a modified PDK1 band with molecular weight of 210kDa. Further experiments confirmed that the band was SUMO modified PDK1.After overexpression of FLAGPDK1 and HASUMO1, the band was infected with IBDV, and then collected at 1h after infection, and then was caught by FLAG antibody. Using anti-HA antibody to detect, the bands can be detected at 210KD, which further proves the SUMO modification of PDK1. The SUMO modification sites of PDK1 were predicted to be 207th, 296th and 495th, respectively. The SUMO modification level of PDK1 was significantly decreased after the lysine was mutated into arginine at the same time. It was also found that the point mutation of PDK1 could inhibit the phosphorylation of downstream AKT and S6K. The phosphorylation levels of AK T and S6K in VP3 transfected cells were significantly up-regulated. Therefore, this study showed that viral infection could induce SUMO modification of PDK1. And the SUMO modification of PDK1 has an important effect on the phosphorylation activity of downstream AKT and S6K. Since the SUMO modification of PDK1 plays an important role in the cell, The mechanism of intracellular regulation of PDK1 SUMO is especially important. Using PDK1 as bait protein to catch intracellular protein, we find that PDK1 can catch about 110 KD bands. The band was identified as VPS34.The direct interaction between PDK1 and VPS34 was verified by CO-IP and PULL DOWN techniques. Further experiments proved that overexpression of VPS34 could inhibit SUMO1 modification of PDK1. At the same time, we found that VPS34 could inhibit SUMO1 modification of PDK1. Can break the interaction between PDK1 and UBC9, Thus inhibiting the SUMO modification of PDK1 catalyzed by UBC9. Therefore, it has been shown that VPS34 can negatively regulate the SUMO modification of PDK1. SUMO plays an important role in the function of PDK1 protein. However, the mechanism of SUMO modification in regulating the activity of PDK1 substrate AKT is still unclear. The ultrahigh resolution results show that the SUMO modification of PDK1 can promote the transfer of PDK1 to the perimembrane. The results of immunoprecipitation further confirmed that SUMO could promote the interaction between PDK1 and AKT, and that the interaction between PDK1 and AKT was necessary for the phosphorylation of AKT. In addition, the study showed that IBDV interacted with VPS34 through VP3. Thus, the interaction between VPS34 and PDK1 is broken, and the SUMO of PDK1 is promoted. The functional domain of VP3 is analyzed. It is found that VP3 interacts with VPS34 through CC3 domain, while VP3 interacts with Beclin-1 through CC1 domain. But VP3 regulates the activity of PDK1 modified band and AKT through CC3. Therefore, it can be determined that VP3 regulates AKT by VPS34, not Beclin-1. Studies also show that VP3 inhibits autophagy through the AKT pathway rather than Beclin-1. Therefore, this chapter suggests that viral infection can regulate the SUMO state of PDK1 through the interaction of VPS34 and PDK1. And further regulate the activity of AKT, thereby regulating the infection of the virus.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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6 姜國勝,唐天華;病毒感染和胰島素依賴型糖尿病[J];國外醫(yī)學(xué).內(nèi)分泌學(xué)分冊;1990年01期

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9 章漳;王碩;邱宏;王崢濤;丁侃;;硫酸乙酰肝素蛋白聚糖與病毒感染[J];中國醫(yī)療前沿;2009年03期

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6 ;EB病毒感染與血液疾病[A];2013年國家級“惡性血液系統(tǒng)疾病診治新進展”學(xué)習(xí)班暨學(xué)術(shù)年會資料匯編[C];2013年

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