本文關(guān)鍵詞： 梨小食心蟲 氣味結(jié)合蛋白 化學(xué)感受蛋白 嗅覺通訊 寄主植物揮發(fā)物 觸角電位反應(yīng)　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：梨小食心蟲是一種重要的世界性果樹害蟲,桃、梨、蘋果等薔薇科仁果類和核果類果樹是其主要的寄主植物。梨小食心蟲具有典型的季節(jié)性轉(zhuǎn)移寄主危害習(xí)性,在我國春季和夏初主要為害桃樹新梢,夏末和秋季轉(zhuǎn)移至梨園危害梨果,這一習(xí)性是引起桃梨混栽區(qū)梨小食心蟲常年猖獗成災(zāi)的重要原因。研究表明寄主植物釋放的揮發(fā)物組分變化是誘導(dǎo)該蟲季節(jié)性轉(zhuǎn)移寄主危害的重要原因,靈敏的嗅覺系統(tǒng)在梨小食心蟲覓食、求偶、繁殖中起著重要作用。目前,梨小食心蟲識別寄主植物揮發(fā)物的機制問題還不清楚。梨小食心蟲嗅覺相關(guān)蛋白基因的鑒定及功能解析有助于掌握昆蟲嗅覺識別的分子機制,也可為干擾昆蟲嗅覺識別來防治目標(biāo)害蟲提供理論依據(jù)。本文通過二代轉(zhuǎn)錄組測序,從梨小食心蟲觸角中鑒定到大量的嗅覺相關(guān)基因,并對氣味結(jié)合蛋白、化學(xué)感受蛋白的組織表達、結(jié)合特性及與配體的特異性結(jié)合機制等進行了系統(tǒng)深入的研究,主要結(jié)果如下:采用Illumina Mesiq二代測序平臺對梨小食心蟲雌蟲觸角進行轉(zhuǎn)錄組測序,利用SOAPdenovo-Trans,Trans-ABySS和Trinity組裝軟件對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別進行從頭拼接,并用DETONATE和Transrate對組裝的準(zhǔn)確性進行評估,結(jié)果表明Trinity獲得的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量最多、平均長度最長、N50最大,Trans-Abyss次之,SOAPdenovo-trans組裝效果最差。通過基因功能注釋從梨小食心蟲觸角轉(zhuǎn)錄組中鑒定出28個氣味結(jié)合蛋白OBP基因,17個化學(xué)感受蛋白CSP基因,48個氣味受體OR基因,4個味覺受體GR基因,24個離子受體IR基因,2個感受神經(jīng)元膜蛋白SNMP基因及1個氣味降解酶ODE基因。在鑒定到的28個OBP中,21個具有完整的開放閱讀框,長度357~756 bp。在具有完整編碼區(qū)的21個OBP中,GmolOBP14第2、5位的半胱氨酸被其他氨基酸取代,屬于“Minus C”亞族OBP,其他20個OBP具有六個保守的半胱氨酸殘基及N端20個左右的信號肽序列,屬于“典型OBP”。半定量RT-PCR顯示,GmolOBP1除在雌、雄蟲觸角中表達外,還在雌蟲身體中表達;GmolOBP2特異性地在雌蟲觸角和身體中表達;GmolOBP6和Gmol OBP18廣泛分布在觸角及身體其他組織。其他22個OBP基因在觸角中特異性表達。推測在觸角中特異性或高表達量的OBP在梨小食心蟲寄主定位、產(chǎn)卵場所選擇等行為中起著重要作用。在鑒定到的17個CSP中,15個具有完整的開放閱讀框,均具有4個保守的半胱氨酸殘基和N端17~25個氨基酸組成的信號肽。半定量RT-PCR表明,除CSP6、CSP7和CSP9在觸角中特異性表達外,其余CSP在雌、雄蟲觸角和其他組織中均有分布。梨小食心蟲CSP除能感受識別揮發(fā)性氣味物質(zhì)外,還可能參與其他的生理活動。利用原核表達系統(tǒng)成功表達了5個OBP蛋白和5個CSP蛋白,并采用His標(biāo)簽親和層析柱對重組蛋白進行了純化。利用熒光競爭結(jié)合試驗對重組OBP和CSP的結(jié)合能力進行測定,結(jié)果表明:(1)5個重組obp蛋白均能與梨小食心蟲的1種或多種性信息素強烈結(jié)合,而5個csp蛋白均不能與性信息素結(jié)合。(2)gmolgobp1具有廣泛的結(jié)合譜,與癸烷的結(jié)合能力最強,結(jié)合常數(shù)為5.64μm;gmolgobp1對醇類、酯類物質(zhì)也有較高的結(jié)合活性。表明gmolgobp1具有識別寄主植物揮發(fā)物和性信息素的雙重功能。(3)gmolgobp2能特異性地結(jié)合性信息素十二烷醇,gmolgobp2具有與pbps相似的功能,推測gmolgobp2在成蟲求偶、交配中起重要作用。(4)gmolobp8、gmolobp11與癸醛、己酸丁酯和α-羅勒烯的結(jié)合能力最強,結(jié)合常數(shù)分別為9.82,10.03,11.06μm和12.69,12.97,16.79μm。(5)gmolobp15與己醛、庚醛的結(jié)合能力最強,結(jié)合常數(shù)分別為5.52和14.81μm。gmolobp15的主要功能與結(jié)合己醛、庚醛等醛類寄主植物揮發(fā)物有關(guān)。(6)gmolcsp8能與己醇、3-甲基丁醇等小分子量的醇類物質(zhì)特異性結(jié)合,而gmolcsp2、gmolcsp3、gmolcsp9和gmolcsp11與寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合能力很弱或不結(jié)合。與obp相比,梨小食心蟲csp蛋白與氣味分子的結(jié)合更具特異性,在成蟲嗅覺識別中的作用還待進一步深入研究。以家蠶bmorgobp2和尖音庫蚊cpipcsp的晶體結(jié)構(gòu)為模板分別模擬了gmolgobp2和gmolobp8的三維空間結(jié)構(gòu)。預(yù)測gmolgobp2結(jié)合十二烷醇的可能位點為thr9,val111和val114,gmolobp8結(jié)合乙酸-反-8-十二碳烯酯的可能位點為thr70,leu74和trp108。利用定點突變技術(shù)將預(yù)測的結(jié)合位點進行點突變。gmolgobp2的突變體t9a與十二烷醇的結(jié)合活性下降了80%,而v111a和v114a沒有明顯的差異,表明thr9是gmolgobp2結(jié)合十二烷醇的關(guān)鍵位點。gmolobp8突變體w108a完全不能與乙酸-反-8-十二碳烯酯結(jié)合,t70a和l74a的結(jié)合能力顯著降低,表明thr70和leu74是gmolobp8的結(jié)合位點,而trp108是結(jié)合乙酸-反-8-十二碳烯酯關(guān)鍵功能位點。全量熒光免疫定位試驗表明,gmolgobp2和gmolobp8均分布在雌、雄蟲觸角的錐形感器中,且gmolgobp2在錐形感器被熒光標(biāo)記的數(shù)量較gmolobp8多。由gmolgobp2和gmolobp8在錐形感器中表達,且能與性信息素強烈結(jié)合的證據(jù)表明,表達gmolgobp2和gmolobp8蛋白的錐形感器中的嗅覺神經(jīng)元對性信息素組分也較敏感。性信息素乙酸-順-8-十二碳烯酯、乙酸-反-8-十二碳烯酯和順-8-十二碳烯醇僅對雄蟲觸角具有電生理活性。桃、梨寄主植物揮發(fā)物1-己醇、反-2-己烯醛、己醛、庚醛、壬醛、癸醛、苯甲醛、乙酸丁酯、乙酸-順-3-己烯酯、乙酸己酯、己酸丁酯均能引起雌、雄蟲觸角較強烈的eag反應(yīng),且雌雄蟲觸角對寄主植物揮發(fā)物的敏感性存在性別差異,如雌蟲對己醛、庚醛、壬醛、癸醛和己酸丁酯的eag反應(yīng)強于雄蟲,雄蟲對乙酸-順-3-己烯酯、乙酸己酯的eag敏感性強于雌蟲。雙向行為選擇試驗表明具有電生理活性的氣味物質(zhì)并不一定有行為活性。昆蟲對寄主植物的識別主要是基于對寄主植物化學(xué)氣味指紋圖譜的確認,但寄主植物釋放的某些關(guān)鍵揮發(fā)物對昆蟲的定位起著重要的指向作用。如反-2-己烯醛和己酸丁酯對雌蟲有顯著的引誘作用,α-蒎烯對雄蟲表現(xiàn)出強烈的吸引作用。梨小食心蟲觸角中高表達的GmolGST1屬于昆蟲胞質(zhì)型GSTs的delta亞家族基因。Gmol GST1在35℃,pH 7.0 100 mM Tris-HCl環(huán)境中的酶活力最高。以CDNB和GSH為底物,測定GmolGST1的米氏常數(shù)Km為0.232±0.060 mM,最大反應(yīng)速度Vmax為172.80±15.40μmol/mg/min。殺蟲劑對GmolGST1具有一定的抑制作用,但抑制率均低于30%。Gmol GST1對性信息素順-8-十二碳烯醇的降解能力最強,降解效率高達76.43%,對寄主植物揮發(fā)物己酸丁酯也有較強的活性,降解效率達49.19%。GmolGST1的主要功能是對進入觸角感器細胞內(nèi)的氣味分子或異源有毒物質(zhì)進行清除,保證嗅覺系統(tǒng)免受損害。
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【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S433
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本文編號：1508932