本文關(guān)鍵詞： 梨小食心蟲(chóng) 氣味結(jié)合蛋白 化學(xué)感受蛋白 嗅覺(jué)通訊 寄主植物揮發(fā)物 觸角電位反應(yīng)　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：梨小食心蟲(chóng)是一種重要的世界性果樹(shù)害蟲(chóng),桃、梨、蘋(píng)果等薔薇科仁果類(lèi)和核果類(lèi)果樹(shù)是其主要的寄主植物。梨小食心蟲(chóng)具有典型的季節(jié)性轉(zhuǎn)移寄主危害習(xí)性,在我國(guó)春季和夏初主要為害桃樹(shù)新梢,夏末和秋季轉(zhuǎn)移至梨園危害梨果,這一習(xí)性是引起桃梨混栽區(qū)梨小食心蟲(chóng)常年猖獗成災(zāi)的重要原因。研究表明寄主植物釋放的揮發(fā)物組分變化是誘導(dǎo)該蟲(chóng)季節(jié)性轉(zhuǎn)移寄主危害的重要原因,靈敏的嗅覺(jué)系統(tǒng)在梨小食心蟲(chóng)覓食、求偶、繁殖中起著重要作用。目前,梨小食心蟲(chóng)識(shí)別寄主植物揮發(fā)物的機(jī)制問(wèn)題還不清楚。梨小食心蟲(chóng)嗅覺(jué)相關(guān)蛋白基因的鑒定及功能解析有助于掌握昆蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別的分子機(jī)制,也可為干擾昆蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別來(lái)防治目標(biāo)害蟲(chóng)提供理論依據(jù)。本文通過(guò)二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,從梨小食心蟲(chóng)觸角中鑒定到大量的嗅覺(jué)相關(guān)基因,并對(duì)氣味結(jié)合蛋白、化學(xué)感受蛋白的組織表達(dá)、結(jié)合特性及與配體的特異性結(jié)合機(jī)制等進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究,主要結(jié)果如下:采用Illumina Mesiq二代測(cè)序平臺(tái)對(duì)梨小食心蟲(chóng)雌蟲(chóng)觸角進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,利用SOAPdenovo-Trans,Trans-ABySS和Trinity組裝軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別進(jìn)行從頭拼接,并用DETONATE和Transrate對(duì)組裝的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果表明Trinity獲得的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量最多、平均長(zhǎng)度最長(zhǎng)、N50最大,Trans-Abyss次之,SOAPdenovo-trans組裝效果最差。通過(guò)基因功能注釋從梨小食心蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組中鑒定出28個(gè)氣味結(jié)合蛋白OBP基因,17個(gè)化學(xué)感受蛋白CSP基因,48個(gè)氣味受體OR基因,4個(gè)味覺(jué)受體GR基因,24個(gè)離子受體IR基因,2個(gè)感受神經(jīng)元膜蛋白SNMP基因及1個(gè)氣味降解酶ODE基因。在鑒定到的28個(gè)OBP中,21個(gè)具有完整的開(kāi)放閱讀框,長(zhǎng)度357~756 bp。在具有完整編碼區(qū)的21個(gè)OBP中,GmolOBP14第2、5位的半胱氨酸被其他氨基酸取代,屬于“Minus C”亞族OBP,其他20個(gè)OBP具有六個(gè)保守的半胱氨酸殘基及N端20個(gè)左右的信號(hào)肽序列,屬于“典型OBP”。半定量RT-PCR顯示,GmolOBP1除在雌、雄蟲(chóng)觸角中表達(dá)外,還在雌蟲(chóng)身體中表達(dá);GmolOBP2特異性地在雌蟲(chóng)觸角和身體中表達(dá);GmolOBP6和Gmol OBP18廣泛分布在觸角及身體其他組織。其他22個(gè)OBP基因在觸角中特異性表達(dá)。推測(cè)在觸角中特異性或高表達(dá)量的OBP在梨小食心蟲(chóng)寄主定位、產(chǎn)卵場(chǎng)所選擇等行為中起著重要作用。在鑒定到的17個(gè)CSP中,15個(gè)具有完整的開(kāi)放閱讀框,均具有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基和N端17~25個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。半定量RT-PCR表明,除CSP6、CSP7和CSP9在觸角中特異性表達(dá)外,其余CSP在雌、雄蟲(chóng)觸角和其他組織中均有分布。梨小食心蟲(chóng)CSP除能感受識(shí)別揮發(fā)性氣味物質(zhì)外,還可能參與其他的生理活動(dòng)。利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了5個(gè)OBP蛋白和5個(gè)CSP蛋白,并采用His標(biāo)簽親和層析柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行了純化。利用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)對(duì)重組OBP和CSP的結(jié)合能力進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明:(1)5個(gè)重組obp蛋白均能與梨小食心蟲(chóng)的1種或多種性信息素強(qiáng)烈結(jié)合,而5個(gè)csp蛋白均不能與性信息素結(jié)合。(2)gmolgobp1具有廣泛的結(jié)合譜,與癸烷的結(jié)合能力最強(qiáng),結(jié)合常數(shù)為5.64μm;gmolgobp1對(duì)醇類(lèi)、酯類(lèi)物質(zhì)也有較高的結(jié)合活性。表明gmolgobp1具有識(shí)別寄主植物揮發(fā)物和性信息素的雙重功能。(3)gmolgobp2能特異性地結(jié)合性信息素十二烷醇,gmolgobp2具有與pbps相似的功能,推測(cè)gmolgobp2在成蟲(chóng)求偶、交配中起重要作用。(4)gmolobp8、gmolobp11與癸醛、己酸丁酯和α-羅勒烯的結(jié)合能力最強(qiáng),結(jié)合常數(shù)分別為9.82,10.03,11.06μm和12.69,12.97,16.79μm。(5)gmolobp15與己醛、庚醛的結(jié)合能力最強(qiáng),結(jié)合常數(shù)分別為5.52和14.81μm。gmolobp15的主要功能與結(jié)合己醛、庚醛等醛類(lèi)寄主植物揮發(fā)物有關(guān)。(6)gmolcsp8能與己醇、3-甲基丁醇等小分子量的醇類(lèi)物質(zhì)特異性結(jié)合,而gmolcsp2、gmolcsp3、gmolcsp9和gmolcsp11與寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合能力很弱或不結(jié)合。與obp相比,梨小食心蟲(chóng)csp蛋白與氣味分子的結(jié)合更具特異性,在成蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別中的作用還待進(jìn)一步深入研究。以家蠶bmorgobp2和尖音庫(kù)蚊cpipcsp的晶體結(jié)構(gòu)為模板分別模擬了gmolgobp2和gmolobp8的三維空間結(jié)構(gòu)。預(yù)測(cè)gmolgobp2結(jié)合十二烷醇的可能位點(diǎn)為thr9,val111和val114,gmolobp8結(jié)合乙酸-反-8-十二碳烯酯的可能位點(diǎn)為thr70,leu74和trp108。利用定點(diǎn)突變技術(shù)將預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變。gmolgobp2的突變體t9a與十二烷醇的結(jié)合活性下降了80%,而v111a和v114a沒(méi)有明顯的差異,表明thr9是gmolgobp2結(jié)合十二烷醇的關(guān)鍵位點(diǎn)。gmolobp8突變體w108a完全不能與乙酸-反-8-十二碳烯酯結(jié)合,t70a和l74a的結(jié)合能力顯著降低,表明thr70和leu74是gmolobp8的結(jié)合位點(diǎn),而trp108是結(jié)合乙酸-反-8-十二碳烯酯關(guān)鍵功能位點(diǎn)。全量熒光免疫定位試驗(yàn)表明,gmolgobp2和gmolobp8均分布在雌、雄蟲(chóng)觸角的錐形感器中,且gmolgobp2在錐形感器被熒光標(biāo)記的數(shù)量較gmolobp8多。由gmolgobp2和gmolobp8在錐形感器中表達(dá),且能與性信息素強(qiáng)烈結(jié)合的證據(jù)表明,表達(dá)gmolgobp2和gmolobp8蛋白的錐形感器中的嗅覺(jué)神經(jīng)元對(duì)性信息素組分也較敏感。性信息素乙酸-順-8-十二碳烯酯、乙酸-反-8-十二碳烯酯和順-8-十二碳烯醇僅對(duì)雄蟲(chóng)觸角具有電生理活性。桃、梨寄主植物揮發(fā)物1-己醇、反-2-己烯醛、己醛、庚醛、壬醛、癸醛、苯甲醛、乙酸丁酯、乙酸-順-3-己烯酯、乙酸己酯、己酸丁酯均能引起雌、雄蟲(chóng)觸角較強(qiáng)烈的eag反應(yīng),且雌雄蟲(chóng)觸角對(duì)寄主植物揮發(fā)物的敏感性存在性別差異,如雌蟲(chóng)對(duì)己醛、庚醛、壬醛、癸醛和己酸丁酯的eag反應(yīng)強(qiáng)于雄蟲(chóng),雄蟲(chóng)對(duì)乙酸-順-3-己烯酯、乙酸己酯的eag敏感性強(qiáng)于雌蟲(chóng)。雙向行為選擇試驗(yàn)表明具有電生理活性的氣味物質(zhì)并不一定有行為活性。昆蟲(chóng)對(duì)寄主植物的識(shí)別主要是基于對(duì)寄主植物化學(xué)氣味指紋圖譜的確認(rèn),但寄主植物釋放的某些關(guān)鍵揮發(fā)物對(duì)昆蟲(chóng)的定位起著重要的指向作用。如反-2-己烯醛和己酸丁酯對(duì)雌蟲(chóng)有顯著的引誘作用,α-蒎烯對(duì)雄蟲(chóng)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的吸引作用。梨小食心蟲(chóng)觸角中高表達(dá)的GmolGST1屬于昆蟲(chóng)胞質(zhì)型GSTs的delta亞家族基因。Gmol GST1在35℃,pH 7.0 100 mM Tris-HCl環(huán)境中的酶活力最高。以CDNB和GSH為底物,測(cè)定GmolGST1的米氏常數(shù)Km為0.232±0.060 mM,最大反應(yīng)速度Vmax為172.80±15.40μmol/mg/min。殺蟲(chóng)劑對(duì)GmolGST1具有一定的抑制作用,但抑制率均低于30%。Gmol GST1對(duì)性信息素順-8-十二碳烯醇的降解能力最強(qiáng),降解效率高達(dá)76.43%,對(duì)寄主植物揮發(fā)物己酸丁酯也有較強(qiáng)的活性,降解效率達(dá)49.19%。GmolGST1的主要功能是對(duì)進(jìn)入觸角感器細(xì)胞內(nèi)的氣味分子或異源有毒物質(zhì)進(jìn)行清除,保證嗅覺(jué)系統(tǒng)免受損害。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S433
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本文編號(hào)：1508932