本文關(guān)鍵詞： Rspo1 β-catenin 敲降 卵巢分化 延遲 減數(shù)分裂 雄性化 尼羅羅非魚　出處：《西南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：長期以來,性別決定和性別分化在生殖生物學(xué)領(lǐng)域一直備受關(guān)注。曾經(jīng)有一段時間科學(xué)家認(rèn)為哺乳動物中卵巢的發(fā)育是一個默認(rèn)和被動的過程。但最近對哺乳類研究發(fā)現(xiàn),雌性性別決定也是由Foxl2、R-spondin1(Rspo1)、Wnt4和β-catenin等轉(zhuǎn)錄因子嚴(yán)格控制之下的多基因參與的分子級聯(lián)。哺乳動物性別決定是一個雄性的(Sry/Sox9/Fgf9)和雌性的(Rspo1/Wnt/β-catenin和Foxl2)信號通路的拮抗過程。表達(dá)數(shù)據(jù)暗示Rspo1/Wnt/β-catenin信號通路可能參與炓鯛、青溕、斑馬魚、羅非魚等硬骨魚類的性腺分化。硬骨魚類同時存在兩個β-catenin(簡寫為β-cat)基因,即β-cat1,β-cat2,并且它們編碼的氨基酸在N端以及中間的犰狳區(qū)域都很保守,而C端轉(zhuǎn)錄激活域差異較大,這種C端轉(zhuǎn)錄激活域的差異對β-cat轉(zhuǎn)錄激活靶基因能力有無影響,兩個β-cat在硬骨魚類性腺發(fā)育過程中又分別扮演什么角色都不清楚。為了更直接、更深入地研究Rspo1/β-cat信號通路在硬骨魚類雌性性別分化過程中的作用,我們進一步研究了羅非魚Rspo1、β-cat1和β-cat2基因在性別分化早期的表達(dá)模式,借助TopFlash熒光素酶報告體系研究Rspo1、β-cat1和β-cat2激活靶基因能力,最后通過TALEN基因組編輯技術(shù),從基因缺失的角度深入研究Rspo1/β-cat信號通路的功能。同時,我們表達(dá)并純化出該信號通路抑制因子Dkk1的重組蛋白,并用純化的Dkk1和該信號通路的化學(xué)抑制劑FH535分別離體孵育羅非魚卵巢,檢測相關(guān)基因表達(dá)變化。本研究是首次在硬骨魚類通過基因敲降的在體實驗和離體孵育相結(jié)合的方式,直接證明該信號通路在雌性性別分化過程中的重要作用。具體結(jié)果如下:1.鑒于硬骨魚類兩個β-cat氨基酸序列在C端轉(zhuǎn)錄激活域差異較大,我們分別將β-cat1缺失C端序列和β-cat2末端加入VP16激活域序列連入pcDNA3.1(β-cat1-C--pcDNA3.1,β-cat2-VP16-pcDNA3.1),借助TopFlash熒光素酶報告體系,探討β-cat1和β-cat2激活靶基因的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-cat1可以激活TopFlash熒光素酶表達(dá),而Rspo1和β-cat2不能。但Rspo1能夠增強β-cat1激活的TopFlash熒光素酶表達(dá)。β-cat2卻可以通過與β-cat1發(fā)生相互作用而增強β-cat1激活的TopFlash熒光素酶表達(dá);β-cat2-VP16可以激活熒光素酶的表達(dá),而β-cat1-C-轉(zhuǎn)錄激活能力大大降低。2.熒光定量PCR結(jié)果顯示Rspo1、β-cat1和β-cat2在卵巢中從孵化后20天開始上調(diào),結(jié)合前期的原位雜交和免疫組化數(shù)據(jù),我們推測Rspo1、β-cat1和β-cat2可能參與羅非魚雌性減數(shù)分裂過程。3.通過TALEN基因組編輯技術(shù)敲降Rspo1。與對照組相比,Rspo1敲降XX羅非魚性腺在孵化后2個月發(fā)育延遲,生殖細(xì)胞停留在卵原細(xì)胞階段,無卵母細(xì)胞。同時免疫組化實驗表明,與對照相比,Rspo1敲降性腺中Vasa陽性細(xì)胞減少,但Rspo1敲降不影響雌激素合成酶Cyp19a1a在性腺體細(xì)胞表達(dá);到孵化后6個月,Rspo1敲降個體性腺發(fā)育得到恢復(fù),與對照相比卻可以檢測到雄激素合成酶Cyp11b2和雄性支持細(xì)胞標(biāo)記因子Dmrt1的表達(dá),同時血清中雄激素(11-KT)水平顯著上調(diào),而雌激素(E2)水平并沒有發(fā)生變化。4.在孵化后60天,對照組卵巢中出現(xiàn)I、II時相卵母細(xì)胞,在β-cat1或β-cat2敲降60天的XX性腺,無I、II時相卵母細(xì)胞的形成,生殖細(xì)胞停留在卵原細(xì)胞時期。免疫組化表明,與對照相比,在雌性個體敲降β-cat1或β-cat2不影響雌激素合成酶Cyp19a1a在性腺體細(xì)胞的表達(dá);3月齡的β-cat1或2敲降雌魚出現(xiàn)I、II時相的卵母細(xì)胞,而性腺表現(xiàn)為雄性因子Dmrt1、Cyp11b2陽性,而對照卵巢檢測不到Dmrt1、Cyp11b2;到6月齡,β-cat1或2敲降雌魚卵巢發(fā)育趕上對照組,但此時的卵巢仍表現(xiàn)為Cyp11b2陽性,同時血清中雄激素水平比雌性對照高,但雌激素水平與對照沒差異。熒光定量PCR和Western blot結(jié)果表明,與對照比Foxl2、Dmrt1、Cyp11b2在β-cat1或2敲降雌魚性腺中上調(diào),Cyp19a1a表達(dá)沒發(fā)生變化。5.當(dāng)用30μg/ml Dkk1重組蛋白或者50μM化學(xué)抑制劑FH535孵育180天羅非魚卵巢4天后,均引起β-cat1和2表達(dá)下調(diào),foxl2、dmrt1、cyp11b2表達(dá)上調(diào),而cyp19a1a表達(dá)沒發(fā)生變化。同時,免疫組化顯示,6月齡羅非魚卵巢經(jīng)Rspo1/Wnt/β-catenin信號通路抑制劑FH535離體孵育4天后Cyp19a1a表達(dá)沒發(fā)生變化,Foxl2、Dmrt1和Cyp11b2表達(dá)上調(diào)。綜上,在硬骨魚類中Rspo1可以激活β-cat1介導(dǎo)的信號通路,并在卵巢分化和維持中起重要作用;硬骨魚類中β-cat1和β-cat2通過協(xié)同作用發(fā)揮作用;這個信號通路在雌性個體中通過抑制雄性基因的表達(dá)和雄激素的合成而維持卵巢的雌性特征;盡管Rspo1、β-cat1或β-cat2敲降和離體孵育實驗中foxl2上調(diào),但是cyp19a1a表達(dá)沒有發(fā)生變化,暗示硬骨魚類中很有可能存在一條獨立于雌激素合成的Foxl2通路。
[Abstract]:In order to study the role of Rspo1 / 尾 - cat1 and 尾 - cat2 in the process of sex differentiation , we further studied the role of Rspo1 , 尾 - cat1 and 尾 - cat2 in the process of sex differentiation of female ( Sry / Sox9 / FAD9 ) and female ( Rspo1 / Wnt / 尾 - catenin and Foxl2 ) . There was no change in the expression of estrogen synthase Cyp19a1a in the ovary of the control group . The expression of Cyp19a1a in the ovary of the control group was higher than that of the control group , but the expression of the estrogen ( E2 ) was not changed .

【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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1 吳利敏;Rspo1和β-catenin在羅非魚卵巢分化、維持過程中的功能研究[D];西南大學(xué);2016年

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本文編號：1501761