本文關(guān)鍵詞： A型流感病毒 NS1基因 hnRNP C2 反向遺傳 相互作用 RNAIP　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：流感病毒至今仍是威脅人類和動(dòng)物生命安全最具破壞性的病原體之一,其中流行范圍最廣、危害最嚴(yán)重的為A型流感病毒。在分類上,A型流感病毒(Influenza A virus, IAV)屬于正黏病毒科(Orthomyxoviridae Family)流感病毒屬。依據(jù)血凝素(Hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)抗原性的差異,A型流感病毒又可進(jìn)一步分為18個(gè)HA亞型和11個(gè)NA亞型。A型流感病毒的基因組為8個(gè)節(jié)段的單股、負(fù)鏈RNA,并且具有廣泛的感染宿主,這些特性使其在復(fù)制過(guò)程中很容易發(fā)生變異和重組。其中非結(jié)構(gòu)蛋白NS1在病毒感染早期就開始表達(dá)并進(jìn)入宿主細(xì)胞核與多種因子發(fā)生相互作用,參與病毒的復(fù)制周期以及拮抗宿主的干擾素系統(tǒng)等等。但關(guān)于這方面的報(bào)道還相對(duì)較少,NS1調(diào)控的具體機(jī)制還不甚明了。為此,本研究選取不同亞型流感病毒的NS1,探討其在宿主細(xì)胞核內(nèi)與何種宿主因子發(fā)生相互作用以及如何調(diào)控病毒的復(fù)制及其毒力,旨在為深入研究流感病毒的復(fù)制周期和尋找潛在的藥物治療靶點(diǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。1.不同亞型流感病毒的分離鑒定與遺傳演化分析2013年2月,一種新型的H7N9流感病毒跨物種感染人并造成感染患者死亡。為了溯清人感染H7N9的源頭,本研究從人感染H7N9的活禽交易市場(chǎng)采集樣本,包括5份環(huán)境樣本、1份鵪鶉咽拭子、1份鴨的肛拭子和11份雞的咽、肛拭子共18份樣品。宏基因組測(cè)序分析顯示這些樣本中存在著H5、H7、H9、 N1、N2、N9不同亞型流感病毒的混合感染。隨后,本研究從這些樣本中分離出H5N9、H7N9和H9N2亞型流感病毒。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明：該H5N9毒株的HA基因來(lái)源于A/Muscovy duck/Vietnam/LBM227/2012(H5N1),屬于2.3.2.1分支。NA基因來(lái)源于A/Hangzhou/1/2013(H7N9)。其6個(gè)內(nèi)部基因與H5N1、H7N9、H9N2的同源性最高。該毒株的HA裂解位點(diǎn)為PQRERRRKR/GL,是典型的高致病性禽流感病毒的裂解位點(diǎn)。受體結(jié)合試驗(yàn)表明：該毒株僅與a-2,3唾液酸受體結(jié)合,而不與a-2,6受體結(jié)合。該H5N9亞型高致病性禽流感病毒為H5N1、H7N9與H9N2亞型流感病毒的三源重組病毒。活禽交易市場(chǎng)對(duì)公共衛(wèi)生及養(yǎng)禽業(yè)構(gòu)成了一種潛在的傳播風(fēng)險(xiǎn)。2.宿主核不均一核糖核蛋白C2 (Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein C2, hnRNP C2)與A型流感病毒NS1的相互作用關(guān)系研究在A型流感病毒感染宿主的過(guò)程中,NS1作為一種多功能調(diào)節(jié)蛋白可與多種宿主蛋白發(fā)生相互作用。hnRNP C2是真核生物細(xì)胞核內(nèi)含量較為豐富的蛋白之一,對(duì)宿主細(xì)胞mRNA前體的剪切、加工、運(yùn)輸?shù)鹊染哂兄匾淖饔�。本研究發(fā)現(xiàn)在不同亞型流感病毒(H3N2、H7N9、H9N2、H1N1和H5N9)感染人肺上皮細(xì)胞系(A549)的過(guò)程中,NS1基因與宿主hnRNP C2存在共定位并在細(xì)胞核中呈現(xiàn)彌散或團(tuán)塊狀聚集。通過(guò)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)、RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀(RNA-binding protein immunoprecipitation, RNA-IP)和GST Pull-Down試驗(yàn),本研究發(fā)現(xiàn)NS1與hnRNP C2之間存在相互作用,這種互作需要RNA的參與但對(duì)RNA的種類不具有特異性,RNA在NS1與hnRNPC2之間起到一種橋梁的作用。這種互作在A型流感病毒中普遍存在,是一種保守的現(xiàn)象。精細(xì)定位研究結(jié)果表明：hnRNP C2的互作區(qū)域在氨基酸(amino acid, aa)aa.107-119即hnRNP C2比hnRNP C1多出的13個(gè)氨基酸。NS1的互作區(qū)域在N端前73個(gè)氨基酸的RNA結(jié)合域(RNA Binding Domain, RBD)。通過(guò)對(duì)NS1 N端1-73的氨基酸序列及其二聚體結(jié)構(gòu)分析,該區(qū)域分為3個(gè)α螺旋：α螺旋1,aa.3-25；α螺旋2,aa.30-50;α螺旋3,aa.54-69。這一區(qū)域帶正電荷的堿性氨基酸可直接與RNA骨架中帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)相結(jié)合。本研究應(yīng)用丙氨酸掃描(Alanine Scanning)的方法對(duì)這3段區(qū)域帶正電荷的堿性氨基酸精氨酸(Arginine, R)和賴氨酸(Lysine, K)依次突變?yōu)楸彼?Alanine, A),并構(gòu)建一系列的突變體載體。隨后的Co-IP試驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)aa.19-21連續(xù)突變?yōu)锳(R19AK20AR21A)、aa.35-46連續(xù)突變?yōu)锳 (R35AR37AR38AK41AR44AR46A)以及R35A、R37A、R38A、K41A、R46A和R38AK41A的單點(diǎn)或雙點(diǎn)突變體均無(wú)法與Myc-hnRNPC2互作。即這些氨基酸位點(diǎn)對(duì)互作起決定性作用。為了進(jìn)一步分析帶有以上突變位點(diǎn)的重組病毒是否失去與內(nèi)源性hnRNPC2互作的能力,本研究利用A型流感病毒8質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng)拯救帶有單點(diǎn)突變及多點(diǎn)突變氨基酸的重組病毒,Co-IP試驗(yàn)結(jié)果表明：突變體病毒均不再與內(nèi)源性hnRNP C2互作。將這些突變體病毒在雞胚中連續(xù)傳代至第7代(F7)時(shí),各毒株均能夠穩(wěn)定傳代,但Mut.19-21和R35A突變體病毒在NS1的39位氨基酸都有D39N和D39G的伴隨性突變。突變體病毒Mut.35-46的復(fù)制能力減弱HA僅為6 log2,對(duì)雞胚的致死時(shí)間也延長(zhǎng)到40 h,但對(duì)雞胚的ELD50與其它病毒無(wú)明顯區(qū)別。突變體病毒Mut.35-46在MDCK細(xì)胞上的增殖滴度大大減弱,約為野生型病毒的千分之一。3.宿主hnRNP C2在A型流感病毒感染過(guò)程中的功能研究在293T細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)Flag-hnRNP C2后可明顯抑制H5N9亞型流感病毒基因組病毒RNA (virus RNA, vRNA)、互補(bǔ)鏈RNA (complementary RNA, cRNA)及信使RNA (message RNA, mRNA)的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。與過(guò)表達(dá)Flag-N空載對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)Flag-hnRNP C24 μg時(shí),vRNA、cRNA和mRNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平下降的尤為明顯,進(jìn)而影響病毒蛋白的翻譯,并使病毒在MDCK細(xì)胞中的增殖能力減弱。同理,在hnRNP C2沉默的A549細(xì)胞系中感染H5N9,與無(wú)關(guān)干擾對(duì)照組相比,hnRNP C2沉默組中H5N9亞型流感病毒基因組vRNA、 cRNA及mRNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平明顯增強(qiáng),進(jìn)而促進(jìn)病毒蛋白的翻譯,并使其在MDCK細(xì)胞中的增殖滴度上升。
[Abstract]:A new type of influenza A virus ( Influenza A virus , IAV ) is one of the most damaging pathogens in human and animal life safety . In this study , we found that in the process of infection of human lung epithelial cells ( A549 ) with different subtypes of influenza virus ( H3N2 , C - IP ) , RNA - binding protein ( RNA - IP ) and GST Pull - Down . In order to further analyze whether or not the recombinant virus with positive charge is 6 log2 , it can obviously inhibit the replication and transcription of virus RNA ( vRNA ) , complementary strand RNA ( cRNA ) and messenger RNA ( messenger RNA , mRNA ) . The replication and transcription level of vRNA , cRNA and mRNA decreased significantly when Flag - hnRNAP24 渭g was expressed . In the same way , the replication and transcription level of the genomic vRNA , cRNA and mRNA of the influenza A virus was significantly increased in the hnRNC2 - silenced A549 cell line compared with the unrelated interfering control group . In addition , the replication and transcription level of the genomic vRNA , cRNA and mRNA of the hnRNC2 silencing group were significantly enhanced , and the proliferation titer of the virus protein was increased in MDCK cells .

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1499578