本文關(guān)鍵詞： 香蕉 冷脅迫 轉(zhuǎn)錄因子 香蕉枯萎病 基因沉默 特異性啟動(dòng)子　出處：《華南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：香蕉(Musa spp.)是撒哈拉沙漠以南的非洲、南美、中美和亞洲4億多人的主食,也是全世界最受歡迎的第二大水果。近年來,低溫和香蕉枯萎病(Fusarium wilt)是香蕉生產(chǎn)上遇到的兩大毀滅性災(zāi)害。通過基因工程改良香蕉的農(nóng)藝性狀以及增強(qiáng)對(duì)低溫和香蕉枯萎病的抵御能力,是提高全球香蕉產(chǎn)量的根本途徑。本研究在香蕉抗寒育種方面,根據(jù)大蕉(Musa spp.Dajiao,ABB Group)的耐寒性強(qiáng)于香蕉(Musa spp.Cavendish,AAA Group)的特點(diǎn),在前期香蕉和大蕉比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的基礎(chǔ)上,克隆出大蕉MpICE1和MpMYBS3轉(zhuǎn)錄因子基因,并對(duì)冷敏感香蕉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,研究其在香蕉耐寒性方面的功能。本研究在香蕉抗枯萎病育種方面,通過對(duì)香蕉枯萎病菌早期發(fā)育蛋白質(zhì)組學(xué)和24種VCGs類型病原菌基因組的分析,從其基因組保守核心區(qū)域鑒定到了兩個(gè)關(guān)鍵的發(fā)育調(diào)控基因FoERG6和FoERG11,并將這兩個(gè)關(guān)鍵基因作物靶標(biāo)基因,運(yùn)用寄主植物誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)(HIGS)對(duì)感病香蕉品種進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,干擾香蕉枯萎病病原菌生物膜功能,成功培育出了對(duì)香蕉枯萎病有一定廣譜耐性的香蕉新種質(zhì),從理論到實(shí)踐地驗(yàn)證了HIGS在香蕉抗枯萎病應(yīng)用的可行性和有效性。最后,為了建立特異清除植物果實(shí)中外源基因的技術(shù),本研究以擬南芥花原基細(xì)胞決定基因LEAFY的啟動(dòng)子LFY建立了驅(qū)動(dòng)重組酶凡FLP基因的特異基因清除載體pBIN19-LFY-FLP,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將“Gene-Deletor”載體導(dǎo)入擬南芥,然后對(duì)轉(zhuǎn)基因株系的外源基因清除情況進(jìn)行了分析,檢驗(yàn)了花原基細(xì)胞決定基因啟動(dòng)子LFY在擬南芥中的清除效果,最后將“Gene-Deletor”載體對(duì)香蕉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,為香蕉的生物安全性研究提供基礎(chǔ)。其主要研究結(jié)論如下:1.MpICE1和MpMYBS3轉(zhuǎn)錄因子基因特征及生物信息學(xué)分析本研究從大蕉中克隆到兩個(gè)抗寒相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,命名為MpICE1(Genbank登陸號(hào):KM379133)和MpMYBS3(Genbank登陸號(hào):KM379134),并進(jìn)行了生物學(xué)功能預(yù)測(cè)和分析。MpICE1位于香蕉基因組十號(hào)染色體上,其ORF為1680 bp,編碼一個(gè)由559個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),推測(cè)分子量為59 kD,pI=5.09,氨基酸結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析證明MpICE1含有保守的bHLH保守結(jié)構(gòu)域和ACT-like等結(jié)構(gòu)域,屬于擬南芥ICE1同系物,亞細(xì)胞定位表明,MpICE1在水稻原生質(zhì)體中定位于細(xì)胞核。MpMYBS3位于香蕉基因組二號(hào)染色體上,其ORF為981 bp,編碼一個(gè)由326個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),推測(cè)分子量為35.59 kD,pI=9.17,氨基酸結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析證明MpMYBS3含有保守的1R等結(jié)構(gòu)域,與水稻MYBS3具有較近的親緣關(guān)系,其亞細(xì)胞定位也定位于水稻原生質(zhì)體細(xì)胞核中。2.超表達(dá)MpICE1和MpMYBS3提高香蕉的耐寒性對(duì)異源超表達(dá)MpICE1和MpMYBS3的轉(zhuǎn)基因香蕉進(jìn)行分子檢測(cè)和耐寒性測(cè)試,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著冷脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),轉(zhuǎn)基因香蕉植株葉片中脯氨酸含量高于野生對(duì)照,而電導(dǎo)率、丙二醛含量則顯著低于野生型,這可能使超表達(dá)MpICE1和MpMYBS3的香蕉植株耐寒性明顯得到提高。同時(shí),轉(zhuǎn)基因香蕉植株冷響應(yīng)基因表達(dá)量較野生對(duì)照也發(fā)生了顯著變化。這些結(jié)果表明:MpICE1和MpMYBS3轉(zhuǎn)錄因子在香蕉冷響應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要的作用。3.沉默F(xiàn)oc TR4麥角甾醇生物合成途徑兩個(gè)關(guān)鍵基因抑制了香蕉枯萎病的發(fā)生為了驗(yàn)證寄主植物誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)(HIGS)在防控香蕉枯萎病上的可行性,我們將Foc TR4兩個(gè)關(guān)鍵基因FoERG6和FoERG11作為靶標(biāo)基因,構(gòu)建了干擾這兩個(gè)關(guān)鍵基因的RNAi載體,隨后對(duì)感病香蕉品種Cavendish進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化,并成功得到了表達(dá)FoERG6和FoERG11 ds RNAs的轉(zhuǎn)基因材料。分別采用溫室接種和重病圃大田測(cè)試對(duì)轉(zhuǎn)基因材料的抗病性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。溫室接種測(cè)試結(jié)果:2個(gè)月齡的轉(zhuǎn)基因香蕉和野生型傷根處理后,接種濃度為2×106 ml-1孢子懸浮液,14天后轉(zhuǎn)基因材料香蕉枯萎病的發(fā)病率顯著低于野生型;轉(zhuǎn)基因材料根部香蕉枯萎病數(shù)量明顯少于野生型;轉(zhuǎn)基因材料根部Foc TR4病原菌麥角甾醇生物合成途徑中兩個(gè)關(guān)鍵基因FoERG6和FoERG11的表達(dá)量顯著降低。重病圃大田測(cè)試結(jié)果顯示:表達(dá)FoERG6和FoERG11dsRNAs的轉(zhuǎn)基因香蕉植株可顯著降低重病圃內(nèi)香蕉枯萎病的發(fā)病率。4.“外源基因”清除載體的構(gòu)建及清除效果驗(yàn)證本文將構(gòu)建的“Gene-deletor”載體pBIN19-LFY-FLP導(dǎo)入擬南芥,成功獲得了3株轉(zhuǎn)基因純合子株系,對(duì)其根、莖、葉、果莢、果實(shí)等GUS組織染色分析,發(fā)現(xiàn)我們統(tǒng)計(jì)的200顆擬南芥果實(shí)中,只有23顆有GUS蛋白活性,177顆擬南芥果實(shí)并沒有檢測(cè)到GUS蛋白活性,未被染色的果實(shí)初步表明外源基因已經(jīng)被清除,果實(shí)清除效果達(dá)到88.5%,說明我們構(gòu)建的載體在擬南芥中可以達(dá)到良好的清除效果。至于在香蕉中的清除效果,還待得到香蕉果實(shí)后進(jìn)行后續(xù)分析驗(yàn)證。
[Abstract]:Musa spp . In this study , we have identified two key genes for banana wilt resistance by genetic transformation of banana and banana wilt . The results of this study are as follows : 1 . Genetic transformation of banana and banana wilt is carried out . The results are as follows : 1 . Genetic transformation of banana and banana wilt is carried out . The results showed that MpICE1 and MpMYBS3 could improve the cold tolerance of banana plants . and then carrying out subsequent analysis and verification after the banana fruit is obtained .

【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S668.1;S436.68

【參考文獻(xiàn)】

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