發(fā)布時間：2018-02-09 17:14

  本文關鍵詞： 香蕉 冷脅迫 轉錄因子 香蕉枯萎病 基因沉默 特異性啟動子　出處：《華南農業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：香蕉(Musa spp.)是撒哈拉沙漠以南的非洲、南美、中美和亞洲4億多人的主食,也是全世界最受歡迎的第二大水果。近年來,低溫和香蕉枯萎病(Fusarium wilt)是香蕉生產上遇到的兩大毀滅性災害。通過基因工程改良香蕉的農藝性狀以及增強對低溫和香蕉枯萎病的抵御能力,是提高全球香蕉產量的根本途徑。本研究在香蕉抗寒育種方面,根據(jù)大蕉(Musa spp.Dajiao,ABB Group)的耐寒性強于香蕉(Musa spp.Cavendish,AAA Group)的特點,在前期香蕉和大蕉比較轉錄組學研究的基礎上,克隆出大蕉MpICE1和MpMYBS3轉錄因子基因,并對冷敏感香蕉進行遺傳轉化,研究其在香蕉耐寒性方面的功能。本研究在香蕉抗枯萎病育種方面,通過對香蕉枯萎病菌早期發(fā)育蛋白質組學和24種VCGs類型病原菌基因組的分析,從其基因組保守核心區(qū)域鑒定到了兩個關鍵的發(fā)育調控基因FoERG6和FoERG11,并將這兩個關鍵基因作物靶標基因,運用寄主植物誘導基因沉默技術(HIGS)對感病香蕉品種進行遺傳轉化,干擾香蕉枯萎病病原菌生物膜功能,成功培育出了對香蕉枯萎病有一定廣譜耐性的香蕉新種質,從理論到實踐地驗證了HIGS在香蕉抗枯萎病應用的可行性和有效性。最后,為了建立特異清除植物果實中外源基因的技術,本研究以擬南芥花原基細胞決定基因LEAFY的啟動子LFY建立了驅動重組酶凡FLP基因的特異基因清除載體pBIN19-LFY-FLP,并通過農桿菌介導的方法將“Gene-Deletor”載體導入擬南芥,然后對轉基因株系的外源基因清除情況進行了分析,檢驗了花原基細胞決定基因啟動子LFY在擬南芥中的清除效果,最后將“Gene-Deletor”載體對香蕉進行遺傳轉化,為香蕉的生物安全性研究提供基礎。其主要研究結論如下:1.MpICE1和MpMYBS3轉錄因子基因特征及生物信息學分析本研究從大蕉中克隆到兩個抗寒相關轉錄因子,命名為MpICE1(Genbank登陸號:KM379133)和MpMYBS3(Genbank登陸號:KM379134),并進行了生物學功能預測和分析。MpICE1位于香蕉基因組十號染色體上,其ORF為1680 bp,編碼一個由559個氨基酸組成的蛋白質,推測分子量為59 kD,pI=5.09,氨基酸結構和系統(tǒng)進化樹分析證明MpICE1含有保守的bHLH保守結構域和ACT-like等結構域,屬于擬南芥ICE1同系物,亞細胞定位表明,MpICE1在水稻原生質體中定位于細胞核。MpMYBS3位于香蕉基因組二號染色體上,其ORF為981 bp,編碼一個由326個氨基酸組成的蛋白質,推測分子量為35.59 kD,pI=9.17,氨基酸結構和系統(tǒng)進化樹分析證明MpMYBS3含有保守的1R等結構域,與水稻MYBS3具有較近的親緣關系,其亞細胞定位也定位于水稻原生質體細胞核中。2.超表達MpICE1和MpMYBS3提高香蕉的耐寒性對異源超表達MpICE1和MpMYBS3的轉基因香蕉進行分子檢測和耐寒性測試,結果發(fā)現(xiàn),隨著冷脅迫時間的延長,轉基因香蕉植株葉片中脯氨酸含量高于野生對照,而電導率、丙二醛含量則顯著低于野生型,這可能使超表達MpICE1和MpMYBS3的香蕉植株耐寒性明顯得到提高。同時,轉基因香蕉植株冷響應基因表達量較野生對照也發(fā)生了顯著變化。這些結果表明:MpICE1和MpMYBS3轉錄因子在香蕉冷響應信號轉導途徑中發(fā)揮著重要的作用。3.沉默F(xiàn)oc TR4麥角甾醇生物合成途徑兩個關鍵基因抑制了香蕉枯萎病的發(fā)生為了驗證寄主植物誘導基因沉默技術(HIGS)在防控香蕉枯萎病上的可行性,我們將Foc TR4兩個關鍵基因FoERG6和FoERG11作為靶標基因,構建了干擾這兩個關鍵基因的RNAi載體,隨后對感病香蕉品種Cavendish進行了遺傳轉化,并成功得到了表達FoERG6和FoERG11 ds RNAs的轉基因材料。分別采用溫室接種和重病圃大田測試對轉基因材料的抗病性進行了評價。溫室接種測試結果:2個月齡的轉基因香蕉和野生型傷根處理后,接種濃度為2×106 ml-1孢子懸浮液,14天后轉基因材料香蕉枯萎病的發(fā)病率顯著低于野生型;轉基因材料根部香蕉枯萎病數(shù)量明顯少于野生型;轉基因材料根部Foc TR4病原菌麥角甾醇生物合成途徑中兩個關鍵基因FoERG6和FoERG11的表達量顯著降低。重病圃大田測試結果顯示:表達FoERG6和FoERG11dsRNAs的轉基因香蕉植株可顯著降低重病圃內香蕉枯萎病的發(fā)病率。4.“外源基因”清除載體的構建及清除效果驗證本文將構建的“Gene-deletor”載體pBIN19-LFY-FLP導入擬南芥,成功獲得了3株轉基因純合子株系,對其根、莖、葉、果莢、果實等GUS組織染色分析,發(fā)現(xiàn)我們統(tǒng)計的200顆擬南芥果實中,只有23顆有GUS蛋白活性,177顆擬南芥果實并沒有檢測到GUS蛋白活性,未被染色的果實初步表明外源基因已經被清除,果實清除效果達到88.5%,說明我們構建的載體在擬南芥中可以達到良好的清除效果。至于在香蕉中的清除效果,還待得到香蕉果實后進行后續(xù)分析驗證。
[Abstract]:Musa spp . In this study , we have identified two key genes for banana wilt resistance by genetic transformation of banana and banana wilt . The results of this study are as follows : 1 . Genetic transformation of banana and banana wilt is carried out . The results are as follows : 1 . Genetic transformation of banana and banana wilt is carried out . The results showed that MpICE1 and MpMYBS3 could improve the cold tolerance of banana plants . and then carrying out subsequent analysis and verification after the banana fruit is obtained .

【學位授予單位】：華南農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S668.1;S436.68

【參考文獻】

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本文編號：1498443