本文關(guān)鍵詞： 中華蜜蜂 卵黃原蛋白 DNA序列 生物信息 轉(zhuǎn)錄 蛋白質(zhì)合成　出處：《東北師范大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：中華蜜蜂(Apis cerana cerana,簡(jiǎn)稱中蜂)是東方蜜蜂(Apis cerana)的指名亞種,也是我國(guó)本土蜂種資源,具有優(yōu)良的蜂種特性和不可替代的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)作用,在我國(guó)蜂業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有重要地位。未來(lái)中華蜜蜂資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用迫切需要對(duì)中華蜜蜂展開(kāi)系統(tǒng)深入的研究。目前,對(duì)中華蜜蜂的研究,多集中于地理形態(tài)學(xué)、分子系統(tǒng)學(xué)等方面,對(duì)于特定功能基因的研究尚處于起步階段。卵黃原蛋白是當(dāng)前蜜蜂生理生化研究中最活躍的領(lǐng)域之一。本文主要利用DNA克隆、測(cè)序和生物信息學(xué)分析方法,研究了中華蜜蜂卵黃原蛋白基因的全DNA序列及其蘊(yùn)含的生物信息,應(yīng)用SSCP-PCR技術(shù)分析了中華蜜蜂卵黃原蛋白基因外顯子基因型特征,利用qRT-PCR技術(shù)研究了中華蜜蜂蜂王、工蜂和雄蜂在不同發(fā)育階段卵黃原蛋白基因的mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性,利用SDS-PAGE和Western blot技術(shù)測(cè)試分析了中華蜜蜂蜂王、工蜂和雄蜂在不同發(fā)育階段卵黃原蛋白的合成特點(diǎn)。主要研究成果如下:1、中華蜜蜂卵黃原蛋白基因一級(jí)結(jié)構(gòu)中華蜜蜂卵黃原蛋白基因序列由6496bp堿基組成,其中C+G含量為46.14%,與意大利蜜蜂(A.mellifera ligustica)的同源性為92%。中華蜜蜂卵黃原蛋白基因序列由7個(gè)外顯子組成,總計(jì)編碼1689個(gè)氨基酸。2、中華蜜蜂卵黃原蛋白預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)合成中華蜜蜂卵黃原蛋白的氨基酸序列N-末端具有一個(gè)識(shí)別因子位點(diǎn),此位點(diǎn)為絲氨酸富集區(qū),是典型的真核生物基因結(jié)構(gòu)特征;在846~856位點(diǎn)上具有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),即HSFPTETgLPF;具有翻譯后修飾位點(diǎn)89個(gè),其中有75個(gè)是磷酸化位點(diǎn),磷酸化是蜜蜂卵黃原蛋白翻譯后最主要的修飾方式。3、中華蜜蜂卵黃原蛋白基因外顯子基因型在海南中蜂第五外顯子中發(fā)現(xiàn)A、B、L、M、N五個(gè)等位基因,AA、AB、LM和LN四個(gè)基因型,其中AB型和LN型是海南中蜂特異的優(yōu)勢(shì)基因型,其它地區(qū)中華蜜蜂樣本未見(jiàn)此基因型檢出。海南中蜂種群處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài),具有獨(dú)立的遺傳結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。推斷海南中蜂最小的外部形態(tài)長(zhǎng)度指標(biāo)(吻長(zhǎng)、翅長(zhǎng)、翅寬和3+4背板總長(zhǎng)等)可能與其獨(dú)特的基因型(AB型和LN型)相關(guān)聯(lián)。4、中華蜜蜂工蜂卵黃原蛋白基因mRNA的轉(zhuǎn)錄模式基因轉(zhuǎn)錄模式與意大利蜜蜂不同,中華蜜蜂成年工蜂隨著日齡,卵黃原蛋白基因的轉(zhuǎn)錄豐度呈現(xiàn)出間歇式的變化規(guī)律。在工蜂羽化出房第4天、第12天和第19天,卵黃原蛋白基因的mRNA轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)峰值;在羽化出房第1天、第8天和第17天,卵黃原蛋白基因的mRNA轉(zhuǎn)錄活性最低。卵黃原蛋白基因可以在中華蜜蜂工蜂的頭、胸和腹部表達(dá),其中頭部表達(dá)豐度最低,其次是胸部,腹部卵黃原蛋白基因mRNA水平最高(P0.05)。并且無(wú)論在頭、胸、腹部還是血淋巴中,中華蜜蜂工蜂卵黃原蛋白表達(dá)豐度均顯著低于意大利蜜蜂(P0.05)。5、中華蜜蜂蜂王卵黃原蛋白基因的表達(dá)特點(diǎn)中華蜜蜂蜂王羽化出房后一周內(nèi),卵黃原蛋白的表達(dá)豐度緩慢增加。出房一周后性成熟,卵黃原蛋白的表達(dá)水平迅速增加。蜂王在產(chǎn)卵期間卵黃原蛋白表達(dá)量最高。與工蜂相似,卵黃原蛋白基因可以在蜂王的頭、胸和腹部表達(dá),腹部卵黃原蛋白合成量最高(P0.05)。6、中華蜜蜂雄蜂卵黃原蛋白基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白合成特點(diǎn)卵黃原蛋白基因的mRNA在中華蜜蜂雄蜂羽化出房1-3天內(nèi)轉(zhuǎn)錄,但是表達(dá)豐度很低,出房第4天以后再未檢測(cè)到mRNA信號(hào);從各個(gè)日齡雄蜂血淋巴樣本中均未檢出卵黃原蛋白信號(hào)的存在。據(jù)此推測(cè),卵黃原蛋白在雄蜂體內(nèi)無(wú)法順利合成或者合成微量,雄蜂體內(nèi)的卵黃原蛋白功能表現(xiàn)可能是退化的。本研究結(jié)果將對(duì)蜜蜂主要功能基因的開(kāi)發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ),對(duì)保護(hù)和利用我國(guó)特色蜂種資源具有意義。
[Abstract]:The Chinese honeybee (Apis cerana cerana, referred to as the bee) is (Apis cerana) of Apis cerana subspecies, is our native bee species has bee species resources, excellent characteristics and irreplaceable economic, social and ecological effects, occupies an important position in China's economic development in the future. Bee Apis cerana resources protection the development and utilization of the urgent need to initiate a systematic study of Chinese bee. At present, the research on Chinese bee, focused on geographic morphology, molecular systematics, etc., for the study of specific genes is still in the initial stage. Vitellogenin is one of the most active areas of current research in honeybee physiological and biochemical. This paper mainly uses the DNA cloning, sequencing and bioinformatics analysis method, studies the DNA sequence of Chinese honeybee vitellogenin gene and its biological information contained in the application of SSCP-PCR technology in Chinese The bee vitellogenin gene exon genotypes, of Chinese bee queen using qRT-PCR technology, characteristics of workers and drones in the expression of mRNA transcription in different developmental stages of vitellogenin gene, analysis of the Chinese Bee King by SDS-PAGE and Western blot test, workers and drones in the synthesis of characteristics in different developmental stages of eggs vitellogenin. Main research results are as follows: 1, the honeybee vitellogenin gene level structure of Chinese honeybee vitellogenin gene sequence from the 6496bp base composition, the content of C+G was 46.14%, and the Italy bee (A.mellifera ligustica) 92%. homology of honeybee vitellogenin gene sequences from 7 exons encoding 1689 amino acids, total.2, the honeybee vitellogenin predicted amino acid sequence of N- terminal structure synthesis of honeybee vitellogenin has a recognition for Sub site, this site is the serine rich region, is a typical structure of eukaryotic gene; at 846~856 locus with a zinc finger structure, which has HSFPTETgLPF; post-translational modification of 89 loci, of which 75 are phosphorylation sites, phosphorylation of.3 is modified the main way of raw egg yolk bees white translation, the Chinese honeybee vitellogenin gene exon genotypes in Hainan bee exon fifth A, found in B, L, M, N five alleles, AA, AB, LM and LN four genotypes, including type AB and type LN is the predominant genotype in Hainan bee specific, other areas of Chinese bee samples but not in the genes detected in bee populations in Hainan. Hardy-Weinberg equilibrium, genetic structure has the characteristics of independence. Hainan bee inferred the smallest morphological length index (snout length, wing length, fin width and length of the 3+4 backplane etc.) may be related to its unique genotype ( AB type and LN type) associated.4 APIs ceranaceranafabricius vitellogenin gene transcription of mRNA gene transcription pattern model and Italy bee, Apis cerana worker bees with age, transcript abundance of vitellogenin gene showed a variation of intermittent. In fourth days out of real feather workers, and twelfth days the nineteenth day, mRNA transcription of vitellogenin genes in the emergence of real peak; first days, eighth days and seventeenth days, mRNA transcription activity of vitellogenin gene. The lowest vitellogenin gene in the bees on the head, chest and abdomen of the head, which expressed the lowest, followed by chest and abdomen of vitellogenin gene mRNA (P0.05) and the highest level. No matter in the head, chest, abdomen or blood Lin Bazhong, Apis ceranaceranafabricius vitellogenin expression abundance was significantly lower than the Italy bee (P0.05).5, the queen bee egg yolk The original gene expression characteristics of Chinese bee bee emergence room after a week, the expression of vitellogenin increased slowly out of the room. One week after sexual maturity, the expression level of vitellogenin increased rapidly during the spawning period. The queen Huang Yuan oval highest amount of protein expression. And the worker is similar to that of vitellogenin the Queen's head in gene expression, chest and abdomen, abdominal vitellogenin synthesis was the highest (P0.05).6, transcription and protein synthesis of vitellogenin gene of Chinese honeybee drone vitellogenin gene mRNA in the honeybee drone emerged housing within 1-3 days of transcription, but the expression is very low, after a room for fourth days and then did not detect the mRNA signal; from every day old male hemolymph samples were not detected in vitellogenin signal. We speculated that the vitellogenin in the body can not be synthetic or synthetic drone trace, drone body The function of egg yolk protein may be degraded. The results of this study will lay a theoretical foundation for the development and utilization of main functional genes of honeybees, and will be meaningful for the protection and utilization of bee resources in China.

【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S891

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本文編號(hào)：1495363