本文關(guān)鍵詞： 殺魚愛德華氏菌 esrB Ⅲ型分泌系統(tǒng) 效應(yīng)蛋白 轉(zhuǎn)錄組測序 晶體結(jié)構(gòu)　出處：《華東理工大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：殺魚愛德華氏菌(Edwardsiella piscicida)是一種廣宿主的革蘭氏陰性致病菌,能造成許多重要經(jīng)濟魚種的出血性敗血癥,更好地了解其致病機制將有助于開發(fā)安全高效的疫苗來防控愛德華氏菌病。目前已經(jīng)鑒定出多個毒力因子參與到E.piscicida的致病過程中,其中Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)協(xié)助其逃避宿主吞噬細胞的殺傷并在胞內(nèi)增殖,Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)也協(xié)助其在宿主體內(nèi)定植。EsrA-EsrB雙組份系統(tǒng)對T3SS和T6SS有重要的調(diào)控作用,但EsrB在E.piscicida中對毒力以及生理的全局調(diào)控作用尚不清楚。本課題對比了E.piscicida野生株和△esrB缺失株在不同條件下的轉(zhuǎn)錄譜,分析了差異表達基因,尋找受EsrB調(diào)控的宿主適應(yīng)性及毒力相關(guān)基因。我們鑒定了 6個新的效應(yīng)蛋白,它們通過T3SS轉(zhuǎn)運至宿主細胞中,與病原菌的定植及毒力相關(guān)。在此基礎(chǔ)上,我們鑒定了 2個受EsrB直接調(diào)控的基因,在它們的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了結(jié)合EsrB的區(qū)域(Binding box)。我們還利用X射線衍射成功解析了 EsrB C端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)。當EIB202野生株培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中時,T3SS和T6SS的7個胞外蛋白被分泌,而?esrB菌株培養(yǎng)在DMEM中以及野生株培養(yǎng)在LB中時,相關(guān)蛋白不分泌,表明EsrB在DMEM條件下激活T3SS和T6SS的表達或分泌。我們對培養(yǎng)在DMEM和LB中的野生株以及?esrB菌株進行轉(zhuǎn)錄組測序,104個基因受EsrB和DMEM共上調(diào),195個基因受共下調(diào),其中T3SS基因簇35個基因(ETAE_0854-ETAE_0888)中的30個以及T6SS基因簇全部16個基因(ETAE_2428-ETAE_2443)顯著上調(diào)超過4倍,占共上調(diào)基因40%以上。對295個差異表達基因進行功能聚類分析發(fā)現(xiàn),胞內(nèi)運輸及分泌相關(guān)基因顯著上調(diào),包括T3SS、T6SS和鐵攝取相關(guān)基因;能量產(chǎn)生、物質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成以及細菌運動相關(guān)基因被顯著抑制,包括溶血素、粘附素和外膜蛋白。另外,大質(zhì)粒PEIB202不參與細菌的毒力及定植,其中編碼的抗生素抗性基因及Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)相關(guān)基因的表達受EsrB和LB培養(yǎng)條件激活。上述結(jié)果表明EsrB在該菌的毒力和生理適應(yīng)過程中起重要作用。本課題通過胞外蛋白以及TEM-1報告系統(tǒng)對104個共上調(diào)基因進行轉(zhuǎn)運分析,9個候選效應(yīng)蛋白被分泌至胞外并被轉(zhuǎn)運至HeLa細胞中。EseG(ETAE_0866)是已知的T3SS效應(yīng)蛋白,介導(dǎo)微管解聚。EseJ(ETAE_0888)是新近鑒定的T3SS效應(yīng)蛋白,抑制細菌粘附但協(xié)助其在EPC中增殖。EseH(ETAE_1757)是最近報道的T3SS效應(yīng)物,定位于宿主細胞核并抑制宿主JNK/MAPK途徑的磷酸化。ETAE_1586含有木瓜蛋白酶折疊毒素(papain fold toxin)功能域,可能抑制宿主的炎癥反應(yīng);ETAE_1604含有胞外轉(zhuǎn)肽酶功能域,可能參與蛋白質(zhì)的分泌和轉(zhuǎn)運等過程;ETAE_2186屬于硫氧還蛋白;ETAE_2188含有DUF1471功能域;EvpJ(ETAE_2438)含有PAAR結(jié)構(gòu)域,可能協(xié)助T6SS分泌過程;ETAE__3282沒有保守功能域,功能未知。9個蛋白的轉(zhuǎn)運都依賴于T3SS,而T6SS影響EvpJ和ETAE_2188的轉(zhuǎn)運。EIB202侵染巨噬細胞J774A.1以及大菱鲆時,9個候選基因也受到EsrB上調(diào)。CI-seq實驗發(fā)現(xiàn),?eseJ菌株的體內(nèi)存活能力在感染后第3天不顯著地降低,而在第7天顯著降低,表明EseJ協(xié)助細菌在宿主體內(nèi)的定植過程。9個效應(yīng)蛋白缺失的菌株(9?)與?esrB、AT3SS和AT6SS菌株一樣,體內(nèi)存活能力顯著下降,進一步,9A菌株表現(xiàn)出強減毒,免疫大菱鲆之后可以提供較高的免疫保護力。EMSA實驗發(fā)現(xiàn)EsrB和EsrBc(142～214 aa)直接結(jié)合esrC和esaM的啟動子,而不結(jié)合esaB和eseJ的啟動子。通過Footprinting實驗,我們發(fā)現(xiàn)EsrB結(jié)合box與SsrB識別序列的7'-4-7"回文結(jié)構(gòu)十分相似。X光衍射顯示EsrBc由3個α螺旋(H1,H2和H3)組成,同源的NarL家族其他蛋白則均由4個α螺旋組成。EsrBc的H1和H2與家族其他蛋白相似,但H3更長。我們推測EsrBc結(jié)合DNA之后可能發(fā)生構(gòu)象變化,形成H4二聚化結(jié)構(gòu)�；谝褕蟮赖腘arLc-DNA和DosRc-DNA結(jié)構(gòu),我們預(yù)測氨基酸殘基Lys181、Glu184和Leu188負責協(xié)助EsrBc結(jié)合DNA,而Thr182負責與磷酸骨架非特異性結(jié)合。
[Abstract]:In this paper , we have identified six new effector proteins , which have been involved in the pathogenic process of E . piscicida , and we have identified six new effector proteins , which are related to the host adaptability and virulence of EsrA - EsrB . We identified two genes which are directly regulated by EsrB . The results showed that EsrB was not involved in the virulence and colonization of bacteria . The results showed that EsrB and Esrbc ( 142 - 214 aa ) were directly bound to esrB , AT3SS and AT6SS .

【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S941.4

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本文編號：1457506