發(fā)布時(shí)間：2018-01-19 19:04

  本文關(guān)鍵詞： H9N2亞型AIV H10N7亞型AIV 鼠適應(yīng)毒 神經(jīng)嗜性 致病性　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：禽流感病毒(AIV)跨種間屏障感染人與哺乳動(dòng)物是流感病毒研究領(lǐng)域重要的研究課題。臨床調(diào)查與研究表明,AIV不僅可以感染人的呼吸系統(tǒng),也可以感染人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS),造成不同的神經(jīng)病理反應(yīng)而表現(xiàn)出神經(jīng)嗜性和高致病性。然而,多年來,人們主要關(guān)注的是病毒對呼吸系統(tǒng)感染與致病機(jī)制的研究,而對神經(jīng)系統(tǒng)的感染與致病機(jī)制關(guān)注較少。因此,解析AIV適應(yīng)哺乳動(dòng)物并獲得在哺乳動(dòng)物神經(jīng)嗜性和致病性的分子機(jī)制具有重要意義。低致病性H9N2亞型AIV在家禽中廣泛流行,并且近年來表現(xiàn)出逐漸增強(qiáng)的哺乳動(dòng)物感染特性;H10N7亞型AIV可引起家禽的發(fā)病,并導(dǎo)致了多起人感染病例的出現(xiàn)。這些AIV能否獲得對哺乳動(dòng)物的神經(jīng)嗜性和致病性,以及其獲得感染與致病的分子機(jī)制尚不清楚。為解決該問題,本研究中,以H9N2亞型禽流感病毒A/chicken/Shandong/16/05(SD16)和H10N7亞型禽流感病毒A/mallard/Beijing/27/2011(BJ27)為模式研究毒株,以Balb/c小鼠為哺乳動(dòng)物模型,分別在小鼠體內(nèi)進(jìn)行連續(xù)的肺-肺傳代。鼠適應(yīng)性SD16病毒和BJ27病毒分別在傳至第13代和第9代時(shí),感染小鼠在5天內(nèi)全部死亡。之后,我們將獲得的第13代鼠適應(yīng)H9N2病毒和第9代鼠適應(yīng)H10N7病毒在MDCK細(xì)胞上進(jìn)行3輪噬斑純化,并將純化后的單克隆病毒分別命名為SD16-MA和BJ27-MA。通過對鼠適應(yīng)毒的生物學(xué)特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),SD16-MA和BJ27-MA對小鼠的致病性、在小鼠體內(nèi)的復(fù)制力以及在A549細(xì)胞和N2a細(xì)胞中的生長復(fù)制能力均顯著提高;對SD16-MA和BJ27-MA進(jìn)行Sanger測序及序列比對分析發(fā)現(xiàn),與野生型SD16病毒相比,SD16-MA在5個(gè)病毒蛋白上出現(xiàn)8個(gè)保守氨基酸位點(diǎn)的變異,分別為PB2 M147L、PB2 V250G、PB2 E627K、PB1 Y657H、HAL226Q、HAR211K、M1R210K 和 NS1L214F;與野生型 BJ27 病毒相比,BJ27-MA在3個(gè)病毒蛋白上出現(xiàn)5個(gè)保守氨基酸位點(diǎn)的變異,分別為PB2 E158G、PB2 M631L、HAG218E、NA K110E和NA S453I。對兩株鼠適應(yīng)病毒變異基因片段進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn),SD16-MA和BJ27-MA同時(shí)在PB2和HA蛋白上發(fā)生了適應(yīng)性突變,說明病毒血凝素蛋白HA和聚合酶蛋白PB2在AIV跨種間感染中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)PB2 E627K與PB2 M631L的位置較接近,均位于PB2-PB1和PB2-NP結(jié)合區(qū),對AIV提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的聚合酶活性起重要作用;HAL226Q和HAG218E同時(shí)位于HA1區(qū)域的220-loop,均可以影響病毒的唾液酸受體結(jié)合特性,表明病毒聚合酶PB2以及受體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域的變異對AIV的跨種間感染與復(fù)制具有重要作用。為解析鼠適應(yīng)病毒的神經(jīng)感染特性和致病性,本研究利用反向遺傳操作技術(shù),構(gòu)建了 SD16和BJ27病毒的反向遺傳操作系統(tǒng),分別以SD16和BJ27病毒為骨架病毒,替換鼠適應(yīng)毒的突變基因片段,拯救得到5株單基因片段替換的H9N2重組病毒,以及6株單基因和雙基因片段替換H10N7重組病毒,并評價(jià)了重組病毒對小鼠的神經(jīng)嗜性。結(jié)果表明,適應(yīng)性突變PB2M147L、PB2 V250G和PB2 E627K以及HA L226Q和HA R211K對H9N2病毒獲得在小鼠的神經(jīng)嗜性起重要作用;而在H10N7病毒中,只有當(dāng)PB2E158G和PB2M631L以及NAK110E和NAS453I協(xié)同作用時(shí),H10N7病毒才能夠獲得對小鼠的神經(jīng)嗜性。為進(jìn)一步探究鼠適應(yīng)毒對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染與入侵的途徑,本研究將rSD16-MA感染小鼠,感染后每日檢測小鼠鼻粘膜、嗅球、嗅神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)、迷走神經(jīng)節(jié)、交感神經(jīng)節(jié)、大腦及小腦等部位病毒抗原分布。免疫組化染色結(jié)果表明,病毒抗原順次在鼻粘膜、嗅球、嗅神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)中檢測到,之后在大腦和小腦中廣泛分布,表明H9N2AIV可以利用嗅神經(jīng)和三叉神經(jīng)的神經(jīng)通路入侵小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng),而3dpi和5dpi均未在血液中檢測到病毒,證明H9N2 AIV不能通過血行性路徑感染小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。AIV對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染還依賴于病毒與宿主蛋白的互作,脆性X智力低下蛋白(FMRP)是一種mRNA結(jié)合蛋白,主要分布在神經(jīng)細(xì)胞,其可以通過與H1N1病毒(PR8)互作,促進(jìn)病毒的復(fù)制。鑒于FMRP的功能和組織分布,我們推測該蛋白有可能在AIV感染小鼠神經(jīng)系統(tǒng)過程中發(fā)揮重要功能。為了探究FMRP在AIV入侵小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)過程中的作用,本研究探討了 H9N2鼠適應(yīng)毒在野生型(FMRP+/+)及FMRP基因缺失(FMRP-/-)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的復(fù)制能力,發(fā)現(xiàn)當(dāng)FMRP基因缺失后,病毒無法在小鼠腦部有效感染和復(fù)制,直接證明了 FMRP在AIV感染小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要作用。為了進(jìn)一步探究FMRP對AIV在體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞中復(fù)制能力的影響,本研究體外分離FMRP+/+和FMRP-/-乳鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞,并檢測了 H9N2鼠適應(yīng)毒在FMRP+/+和FMRP-/-神經(jīng)元細(xì)胞中的生長復(fù)制能力以及病毒蛋白合成水平。結(jié)果顯示,與FMRP+/+神經(jīng)元細(xì)胞相比,病毒在FMRP-/-細(xì)胞中的復(fù)制力以及病毒蛋白合成能力均顯著降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),SD16-MA的PB2和HA中的適應(yīng)性突變可以通過提高病毒的聚合活性、病毒在神經(jīng)細(xì)胞中的核輸入能力以及病毒對神經(jīng)細(xì)胞的感染特性,增強(qiáng)病毒在小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞N2a中NP蛋白的表達(dá)水平,NP蛋白表達(dá)水平的提高有助于由FMRP和NP互作介導(dǎo)的RNP的合成以及RNP的核輸出,進(jìn)一步促進(jìn)病毒在神經(jīng)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。H9N2 AIV和H10N7 AIV在小鼠體內(nèi)傳代后獲得了對小鼠的高致病性,之前已有研究對H9N2鼠適應(yīng)病毒對哺乳動(dòng)物致病性增強(qiáng)的機(jī)制進(jìn)行了深入探究,本研究重點(diǎn)解析了 H10N7鼠適應(yīng)病毒對小鼠致病性增強(qiáng)的分子機(jī)制。利用反向遺傳技術(shù),本研究拯救得到3株單基因片段替換和5株單個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變H10N7重組病毒,并評價(jià)了重組病毒對小鼠的致病力、體內(nèi)外復(fù)制力、293T細(xì)胞中的聚合酶活性及神經(jīng)氨酸酶活性。結(jié)果顯示,PB2M631L和PB2E158G變異通過提高病毒的聚合酶活性、NAK110E變異通過提高病毒的NA酶活性,對提高病毒的哺乳動(dòng)物適應(yīng)性和致病性起重要作用,其中PB2M631L在這一過程中起決定性作用,是一新發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物適應(yīng)性分子標(biāo)志。綜上所述,本研究揭示了 H9N2和H10N7亞型AIV鼠適應(yīng)病毒對小鼠神經(jīng)嗜性和致病性增強(qiáng)的分子機(jī)制,證明了病毒PB2、HA以及NA蛋白上的適應(yīng)性突變對于AIV在小鼠中的神經(jīng)嗜性起重要作用;H9N2AIV可以通過嗅神經(jīng)和三叉神經(jīng)入侵小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng),且宿主蛋白FMRP在AIV感染小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)過程中扮演重要角色;H10N7 AIV中的PB2 M631L是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物適應(yīng)性分子標(biāo)志。該研究揭示了 AIV適應(yīng)哺乳動(dòng)物并導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)感染的分子機(jī)制,對評估AIV在哺乳動(dòng)物以及人群中的危害和流行潛力提供了理論參考。
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【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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1 朱耐偉;朱勇U，

本文編號：1445182