本文關鍵詞： 弓形蟲 硬脂酰輔酶A去飽和酶 條件性敲除 過表達 自噬　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：龔地弓形蟲（Toxoplasma gondii)是專性細胞內(nèi)寄生原蟲,可以寄生十幾乎所有溫血動物和人的有核細胞。弓形蟲在其寄生生活中,燼管可以從宿主攝取多種營養(yǎng)物質(zhì),但蟲體仍具有相對完善的代謝系統(tǒng),可以進行必要的分解及合成反應。弓形蟲其有從頭合成飽和脂肪酸的能力,但目前尚不清楚弓形蟲中是否能合成不飽和脂肪酸。因此,我們進行了如下研究。已知硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearoyl-coenzyme A desaturase, SCD)是不飽和脂肪酸合成中的關鍵酶。通過蛋白相似性比對發(fā)現(xiàn),弓形蟲中存在與瘧原蟲SCD相似性達54%的推定脂酰輔酶A去飽和酶基因(ToxoDB編號TGGT1_238950)。經(jīng)生物信息學分析,該基因編碼的蛋白質(zhì)具有典型的去飽和酶結(jié)構(gòu)域。通過反轉(zhuǎn)錄PCR從弓形蟲RH株獲得該基因的3129 bp全長編碼序列,與TGGT1_238950勺序列完全一致。隨后,對該蛋白進行了截短原核表達并制備鼠源抗體,蛋白印跡結(jié)果表明弓形蟲速殖子中存在該蛋白的表達,蛋白分子量約為120 kDa,與預期相符。同時構(gòu)建該基因的HA標簽內(nèi)源性標記蟲株,通過間接免疫熒光實驗,發(fā)現(xiàn)蟲體內(nèi)源性蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),與其他去飽和酶定位一致。因此,推定其為弓形蟲的硬脂酰輔酶A去飽和酶,即為弓形蟲SCD (TgSCD)。環(huán)丙烯脂肪酸(如蘋婆酸)是SCD的抑制劑。我們選擇蘋婆酸以及幾種與其結(jié)構(gòu)相似的甲酯化物進行抗弓形蟲的體外藥效實驗,發(fā)現(xiàn)它們都能不同程度抑制胞內(nèi)弓形蟲的增殖與釋放。其中,蘋婆酸抑制弓形蟲的半數(shù)有效濃度最低,但對宿主細胞具有較明顯的毒性作用；另一種含有甲氧基的藥物(編號INT21)對弓形蟲有明顯抑制作用,且其在高濃度下對宿主細胞無明顯毒性。其后,將上述藥物進行小鼠體內(nèi)藥效實驗,腹腔注射INT21可以使Pru株感染小鼠的腦荷蟲量顯著減少,但對RH株感染小鼠無明顯保護作用。為了進一步研究SCD在弓形蟲發(fā)育和增殖中的作刖,在弓形蟲’TATi蟲株中運用CRISPR/Cas9技術獲得SCD的條件性敲除蟲株。經(jīng)噬斑實驗和增殖實驗發(fā)現(xiàn),敲除蟲體的入侵、發(fā)育和繁殖等表型無明顯變化；給小鼠接種1000個速殖子,缺失SCD的蟲株與TATi蟲株對小鼠的毒力差異不顯著,提示弓形蟲速殖子階段生長發(fā)育對SCD的依賴程度不高,可能是在SCD缺失時有其它因子替代或補償其作用。為進一步觀察SCD在蟲體中功能,構(gòu)建了弓形蟲SCD過表達蟲株。對過表達蟲株的脂肪酸檢測發(fā)現(xiàn),蟲體油酸的比例增加,證明弓形蟲SCD在蟲體內(nèi)發(fā)揮了去飽和酶的功能。過表達蟲株的體外表型觀察發(fā)現(xiàn),SCD過表達蟲株增殖速度減慢,入侵能力降低；小鼠接種實驗中,過表達蟲株對小鼠的毒力低于野毒株。通過TgIF2α磷酸化和相關基因表達水平檢測發(fā)現(xiàn)弓形蟲SCD過表達蟲株發(fā)生內(nèi)質(zhì)例應激,并且史易發(fā)生自噬和捌廣。綜上所述,本研究明確了弓形蟲中存在SCD,且能夠發(fā)揮去飽和酶的功能,參與了蟲休白噬：弓7侈蟲SCD的缺失對速殖子階段的生長繁殖沒有顯著影響。本研究初步探索了弓形蟲SCD的生物學功能,為今后研究其作用機制捉供了科學依據(jù)。
[Abstract]:Toxoplasma gondii (Toxoplasma gondii) is an obligate intracellular parasite, can be parasitic ten almost all warm blooded animal and human cells. Toxoplasma gondii in the parasitic life, out from the host intake pipe can be a variety of nutrients, but the body still has a relatively perfect metabolic system, can decompose and synthesis necessary. The ability of Toxoplasma gondii de novo synthesis of unsaturated fatty acids, but it is unclear whether Toxoplasma can synthesize unsaturated fatty acids. Therefore, we carried out the following research. Known stearoyl coenzyme A desaturase (stearoyl-coenzyme A, desaturase, SCD) is a key enzyme in the synthesis of unsaturated fatty acids the protein similarity comparison. Through the discovery, and Plasmodium SCD similar presumption of acyl coenzyme A of 54% desaturase gene in Toxoplasma gondii (ToxoDB No. TGGT1_238950). Bioinformatics analysis of the gene encoding. The protein has a typical desaturase domain. By reverse transcription PCR obtained 3129 full-length BP encoding sequence of the gene from Toxoplasma gondii RH strain, the sequence is completely consistent with TGGT1_238950. Then, the protein was truncated prokaryotic expression and preparation of mouse antibody, Western blotting results showed that the expression of the protein Toxoplasma gondii tachyzoites in the protein molecular weight is about 120 kDa, in line with expectations. At the same time to construct HA label endogenous marker strains of this gene by indirect immunofluorescence assay, found insect endogenous protein located in the endoplasmic reticulum, and other desaturase consistent positioning. Therefore, the presumption of Toxoplasma gondii stearoyl coenzyme A desaturase, namely Toxoplasma SCD (TgSCD). The cyclopropene fatty acids (e.g. sterculic acid) are inhibitors of SCD. We choose sterculic acid and its structure and several similar methyl in vitro anti Toxoplasma drugs Effect experiment, found the proliferation and release them to a different degree of inhibition of intracellular Toxoplasma gondii. Among them, sterculic acid inhibition of Toxoplasma Iabour minimum, but has obvious toxic effect on the host cells; another containing methoxy drugs (No. INT21) had significant inhibitory effects on Toxoplasma gondii and, at a high concentration of host cells without obvious toxicity. Thereafter, the experimental drug efficacy in mice, intraperitoneal injection of INT21 can make the Pru strain infected mice brain worm was significantly reduced, but no significant protective effect on mice infected by the RH strain. In order to further study the SCD in the development and proliferation of Toxoplasma gondii as it is, in the conditional Toxoplasma gondii strains' TATi with CRISPR/Cas9 technology in SCD knockout strains. By pyrethroid plaque assay and proliferation experiments showed that the pest invasion on development and reproduction, no significant changes to the phenotype; Rats inoculated with 1000 tachyzoites, SCD deletion strains and the virulence of different strains of mice TATi were not significant, suggesting that Toxoplasma gondii tachyzoite stage growth depends on SCD is not high, there may be other factors replace or compensate for its role in the absence of SCD. For further study on SCD in worms in function, constructed over expression of SCD strains of Toxoplasma gondii. Overexpression of fatty acid found detection of strains, the body of oleic acid increased in proportion to prove Toxoplasma SCD plays a desaturase function in the parasite strains in vitro. Overexpression phenotype observed that overexpression of SCD strain proliferation slowed down, invasion ability decreased; mice were inoculated with experiment, expression of virulence in mice than wild strain. The level of detection of Toxoplasma gondii SCD overexpression occurred in cases of stress by TgIF2 ER alpha phosphorylation and gene expression, and the history of easy autophagy and eight wide . in summary, this study makes clear the SCD of Toxoplasma gondii, and can play the function of desaturase, involved in insect Hugh autophagy: loss of 7 SCD of luxury arch insect tachyzoite stage had no significant effect on growth and reproduction. This study explore the biological function of Toxoplasma SCD, for further studies the mechanism and provide a scientific basis.

【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7

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本文編號：1442107