本文關(guān)鍵詞：茶樹育性相關(guān)基因的克隆與表達(dá)研究　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 茶樹 育種 自交不親和 轉(zhuǎn)錄組 S-RNase 鈣依賴蛋白激酶

【摘要】：茶樹是一種廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物,由于自交不親和、雜交結(jié)實(shí)率低和品種間雜交結(jié)實(shí)率差異大,導(dǎo)致茶樹遺傳背景復(fù)雜、雜交育種效率低,限制了遺傳學(xué)研究和遺傳改良相關(guān)工作的開展。本研究以茶樹自交不親和機(jī)制為切入點(diǎn),使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法,發(fā)掘茶樹育性相關(guān)基因,對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行克隆,并通過基因分型、基因表達(dá)和蛋白的原核表達(dá)等手段,研究關(guān)鍵基因在茶樹育性分子機(jī)制中的作用。本研究主要結(jié)果如下:1.使用熒光顯微鏡觀察自交(‘福鼎大白茶’ב福鼎大白茶’)和異交(‘福鼎大白茶’ב中茶108’)授粉花柱中花粉管的生長差異。發(fā)現(xiàn)授粉24 h~48 h自交花粉管的生長速度明顯慢于異交花粉管;授粉72 h,異交和自交花粉管均長至花柱基部。表明自交花粉管在花柱中的生長受到了一定程度的抑制,到達(dá)花柱基部的時(shí)間有明顯延遲。2.為了明確自交花粉管生長受抑的分子機(jī)制,本文使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法研究了茶樹自交(self-pollination,SP)和異交(cross-pollination,CP)授粉24 h、48 h和72 h后花柱中基因表達(dá)的差異。獨(dú)立構(gòu)建6個(gè)轉(zhuǎn)錄組測序文庫(CP24、CP48、CP72、SP24、SP48和SP72)分別進(jìn)行測序,共得到了63762個(gè)Unigene。通過比較SP和CP樣本間的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選到大量的差異表達(dá)基因,其中包括Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、植物-病原菌互作和活性氧代謝等過程相關(guān)的基因,為茶樹育性相關(guān)重要基因的篩選奠定了基礎(chǔ)。然后研究了SP和CP樣本中隨授粉時(shí)間變化的基因表達(dá)規(guī)律,發(fā)現(xiàn)花柱對(duì)自花和異花花粉管具有完全不同的響應(yīng)模式,其中83個(gè)參與氧化還原過程基因的上調(diào)表達(dá)在SP樣本中有明顯的延遲,與自交花粉管生長受抑的表型一致,推測這些基因可能直接參與了花粉管生長的調(diào)控。3.對(duì)自交和異交授粉的茶樹子房進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序,拼接得到51200個(gè)Unigene。與根、葉片和花柱的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,篩選到99個(gè)在茶樹子房中特異表達(dá)的基因,這些基因在花粉-雌蕊互作、花粉管引導(dǎo)和雙受精過程中具有重要功能。使用熒光定量PCR的方法,研究了51個(gè)與IAA、乙烯、ABA和GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)Unigene,在SP和CP授粉子房中的表達(dá)規(guī)律,篩選到6個(gè)表達(dá)規(guī)律具有顯著差異的Unigene,分別為:GID1、SAUR、GH3.6、GH3.1、IAA29和ARF1,這些基因可能在茶樹花粉管-子房互作階段具有重要功能。4.S-RNase基因是配子體型自交不親和機(jī)制(gametophytic self-incompatibility,GSI)中的雌性決定因子。本研究從轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因中,篩選并克隆了一個(gè)Cs S-RNase基因(KU852488),該基因全長1121 bp,開放閱讀框全長717 bp,編碼283個(gè)氨基酸殘基;該基因主要在花柱中表達(dá);自交授粉花柱中Cs S-RNase的上調(diào)表達(dá)明顯早于異交花柱,且授粉24 h自交花柱中表達(dá)量顯著高于異交花柱,與自花花粉管受抑時(shí)間一致。檢測該基因在11個(gè)茶樹品種(系)中的基因型,發(fā)現(xiàn)該基因存在豐富的遺傳多態(tài)性。然后將Cs S-RNase定位到了實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的遺傳圖譜上。對(duì)Cs S-RNase基因進(jìn)行原核表達(dá),成功分離到了目標(biāo)蛋白。使用不同Cs S-RNase蛋白濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉,發(fā)現(xiàn)Cs S-RNase能夠明顯抑制自花花粉管的生長。以上結(jié)果表明Cs SRNase符合GSI植物S-RNase基因的典型特征,認(rèn)為茶樹自交不親和性在分子機(jī)制上受GSI機(jī)制控制。5.從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到14個(gè)具有完整開放閱讀框的鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPKs)基因。使用熒光定量PCR檢測CDPKs的組織表達(dá)特異性,發(fā)現(xiàn)5個(gè)Cs CDPKs基因在花粉中特異表達(dá)。然后克隆了這5個(gè)Cs CDPKs的c DNA全長序列。同源比對(duì)發(fā)現(xiàn),它們與多個(gè)擬南芥中參與花粉管極性生長的CDPKs有較高的同源性。5個(gè)Cs CDPKs隨著花粉培養(yǎng)時(shí)間的延長,表達(dá)量呈上升趨勢,其中Cs CPK3、Cs CPK4和Cs CPK5在花粉培養(yǎng)初始階段便有快速響應(yīng)。進(jìn)一步選擇了Cs CPK5設(shè)計(jì)并合成了硫代修飾的反義寡核苷酸鏈,對(duì)該基因在茶樹花粉管中的表達(dá)進(jìn)行特異性的沉默,發(fā)現(xiàn)能夠抑制花粉管的生長,因此Cs CPK5在茶樹花粉管的生長過程中具有重要的功能。
[Abstract]:In order to clarify the molecular mechanism of pollen tube growth , it was found that the growth rate of selfing pollen tube was obviously slower than that of pollen tube . The results showed that the growth rate of selfing pollen tube was obviously slower than that of pollen tube . The expression of Cs S - RNase gene in pollen tube - ovary was studied by fluorescence quantitative PCR . The results showed that the expression of Cs S - RNase was significantly higher than that in the pollen tube . The specific silencing of the expression of the gene in the pollen tube of the tea tree shows that the growth of the pollen tube can be inhibited , so that the Cs CP5 can play an important function in the growth process of the tea tree pollen tube .

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S571.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 瞿禮嘉;;小肽信號(hào)在植物雙受精過程中的作用[J];中國基礎(chǔ)科學(xué);2016年01期

2 許園園;李曉剛;李慧;藺經(jīng);常有宏;;梨CDPK基因家族全基因組序列鑒定分析[J];江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2015年03期

3 張進(jìn);李建波;劉伯斌;陳軍;盧孟柱;;楊樹CDPK基因家族的表達(dá)分析及功能預(yù)測[J];林業(yè)科學(xué)研究;2014年05期

4 張成才;王麗鴛;韋康;成浩;包云秀;劉本英;汪云剛;;基于茶樹SNP的dCAPS標(biāo)記體系研究[J];茶葉科學(xué);2012年06期

5 張雪梅;李保國;秦立者;齊國輝;郭素萍;;自交親和蘋果品種S基因型的鑒定[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);2009年05期

6 王郁;江昌俊;張和禹;;茶樹自交花粉管在活體花柱中的不親和性觀察[J];茶葉科學(xué);2008年06期

7 張一婧;薛勇彪;;基于S-核酸酶的自交不親和性的分子機(jī)制[J];植物學(xué)通報(bào);2007年03期

8 李曉;張紹鈴;陶書田;吳華清;吳俊;;中國櫻桃與甜櫻桃花粉原位萌發(fā)及花粉管生長的差異[J];西北植物學(xué)報(bào);2007年03期

9 陳迪新,張紹鈴,陶書田;沙梨花粉原位萌發(fā)與花粉管生長特性[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2004年03期

10 董麗娟;茶樹雜交育種研究進(jìn)展[J];茶葉科學(xué);2001年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 王雙雙;擬南芥CML25調(diào)控花粉萌發(fā)及花粉管生長的機(jī)理研究[D];山東大學(xué);2015年

2 孟冬;蘋果MdABCF轉(zhuǎn)運(yùn)S-RNase至花粉管影響自交不親和反應(yīng)[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

3 徐曉輝;玉米柱頭全基因組表達(dá)譜分析及花粉—柱頭互作相關(guān)基因的鑒定[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

4 陳暄;茶樹自交不親和類型的鑒定及相關(guān)基因克隆與表達(dá)分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

，

本文編號(hào)：1434653