本文關(guān)鍵詞：柑橘采后生防菌檸檬形克勒克酵母基因組學(xué)分析及青綠霉病原菌特異性檢測(cè)與防治　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：柑橘是世界第一大水果,然而在采后貯運(yùn)時(shí),柑橘果實(shí)會(huì)遭受巨大的腐爛情況,引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,防治腐爛自然而然就成為全世界高度關(guān)注的研究重點(diǎn)。采用化學(xué)防治的方法一直以來是園藝領(lǐng)域相當(dāng)普遍的防治手段,鑒于化學(xué)藥劑的一些缺陷與當(dāng)今綠色農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)、食品安全等主題的沖突,生物防治逐漸為全球重視。其中,生防酵母成為真菌病害防治的主力軍之一。本研究基于高通量測(cè)序,對(duì)柑橘生防菌檸檬形克勒克酵母(34-9)(Kloeckera apiculata)進(jìn)行全基因組測(cè)序,研究其遺傳物質(zhì)的基本特征、進(jìn)化層面的基因特有和共有特征,以及它在整個(gè)酵母菌領(lǐng)域的譜系特有基因特征。另從病原菌的角度開發(fā)特異性的分子標(biāo)記對(duì)柑橘青綠霉病原菌意大利青霉(Penicillium italicum)和指狀青霉(Penicillium digitatum)進(jìn)行快速檢測(cè)。同時(shí)從生防細(xì)菌角度出發(fā),篩選到青綠霉拮抗細(xì)菌解淀粉芽孢桿菌DH-4(Bacillus amyloliquefaciens),并較為深入的研究了其抑菌機(jī)理。主要結(jié)果如下:1.酵母34-9全基因組測(cè)序。本測(cè)序在Illumina Hi Seq 2000平臺(tái)執(zhí)行,采用雙端測(cè)序paired-end(PE)和mate-paired(MP)的方法構(gòu)建了四個(gè)插入文庫(kù),分別為170 bp、500 bp、800bp和3 Kb�？侱NA被組裝為106個(gè)contig序列,最終被進(jìn)一步組裝為41個(gè)scaffold序列,基因組約8.1 Mb,GC含量為32%,測(cè)序覆蓋度234倍。經(jīng)預(yù)測(cè),34-9中含3786個(gè)基因,可編碼3786個(gè)蛋白。其中2724個(gè)蛋白序列能與KOG數(shù)據(jù)庫(kù)匹配并得到功能分類。Uni Prot數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果顯示,1127個(gè)基因得到GO分類注釋�；蚪M中預(yù)測(cè)到3個(gè)r RNA、3個(gè)micro RNA、71個(gè)t RNA、1066個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn),重復(fù)序列占據(jù)0.37%。在代謝途徑預(yù)測(cè)中發(fā)現(xiàn)與苯丙氨酸代謝相關(guān)的基因�；蚱ヅ浜徒Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)檸檬形克勒克酵母獨(dú)特之處,并與克魯維酵母屬有較多同源基因。比較基因組分析發(fā)現(xiàn)34-9與葡萄汁有孢漢遜酵母極高的線性區(qū)域,SSR分析發(fā)現(xiàn)34-9的6種重復(fù)類型中單核苷酸和三核苷酸重復(fù)單元居多。2.酵母34-9共有、特有基因。本分析基于比較基因組和同源比對(duì)法對(duì)有孢漢遜酵母屬內(nèi)已測(cè)序的三種酵母K.apiculata、Hanseniaspora uravum、H.vineae做共有和特有基因分析。首先運(yùn)用Augustus軟件從H.vineae中預(yù)測(cè)到4746個(gè)蛋白序列以供同源比對(duì)。采用Treefam的方法對(duì)三個(gè)酵母的全部蛋白進(jìn)行all-against-all BLASTp比對(duì),最后得到3223個(gè)基因家族,包含1400個(gè)單拷貝基因、310個(gè)多拷貝基因家族,三者共有基因分別為2108個(gè)、2056個(gè)、2242個(gè),特有基因數(shù)目分別為275個(gè)、129個(gè)、1695個(gè)�；蚪M水平的系統(tǒng)發(fā)生分析看出K.apiculata與H.uravum親緣關(guān)系最近。并且三者的共有、特有基因家族獲得功能分類,兩兩之間線性匹配的區(qū)域得到明晰。3.酵母34-9譜系特有基因。本研究立足生物信息學(xué)和同源比對(duì),共收集了80個(gè)已基因組測(cè)序的酵母種,涵蓋了32個(gè)酵母屬的80個(gè)不同種。其中51株酵母的蛋白質(zhì)序列已公布,亦作為參考對(duì)象。3786個(gè)K.apiculata蛋白序列經(jīng)BLASTp、TBLASTN、PSIBLAST多次同源比對(duì),揭示了兩套有孢漢遜酵母屬的譜系特有基因(LSGs):檸檬形克勒克酵母獨(dú)有基因,即孤兒基因(orphan genes)共109個(gè),344個(gè)有孢漢遜酵母屬特有基因(HSGs),其他3333個(gè)基因?yàn)檫M(jìn)化保守基因(ECs)�；蛱攸c(diǎn)分析揭示了LSGs一定的獨(dú)特性:LSGs的外顯子均長(zhǎng)明顯短于ECs,其基因長(zhǎng)度亦短于ECs,GC含量相近,兩套LSGs分布在基因組的34個(gè)scaffold序列上,其分布數(shù)量與scaffold長(zhǎng)度呈顯著共相關(guān)。Prot Fun揭示LSGs的細(xì)胞功能主要集中于翻譯、氨基酸合成、細(xì)胞被膜、能量代謝等。75%的孤兒基因和57%的HSGs存在GO分類,以生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄調(diào)控最為豐富。該功能推斷顯示部分LSGs可能有基因擴(kuò)張的趨勢(shì),LSGs在某些特殊物種中有成為重要管家基因的潛力。新基因起源的分析中發(fā)現(xiàn)有6個(gè)LSGs有旁系同源基因(paralog),其中四個(gè)基因具進(jìn)化保守性,可能來源于基因復(fù)制�？傮w來說,基因復(fù)制不占主導(dǎo)作用。q RT-PCR表明部分LSGs表達(dá)響應(yīng)非生物脅迫,基因34-9_2335和34-9_3527可能與耐寒有關(guān),34-9_280、34-9_882、34-9_1238、34-9_1749、34-9_2335、34-9_3527明顯響應(yīng)熱脅迫,34-9_108、34-9_1238可能與調(diào)節(jié)酸堿有關(guān),34-9_225、34-9_1511、34-9_3527、34-9_3687明顯響應(yīng)堿性環(huán)境。4.青綠霉特異性分子標(biāo)記。在鑒定柑橘病原菌時(shí)偶爾會(huì)遭遇高度同源而無法分辨種類的情況。本部分基于真菌保守基因和青霉屬基因組,將指狀青霉、意大利青霉、產(chǎn)黃青霉、擴(kuò)展青霉的保守基因RPB1、RPB2、cmd、β-tubulin和COI的同源區(qū)域的堿基突變位點(diǎn)作為引物上下游序列,開發(fā)出能特異性檢測(cè)指狀青霉和意大利青霉的引物。特異引物RPB1-1和cmd-3可快速特異地檢測(cè)出指狀青霉,38株對(duì)象菌株中共有14株最終被鑒定為指狀青霉。另外,引物RPB1-a和RPB1-b可快速特異檢測(cè)意大利青霉,共從39株對(duì)象菌株中檢測(cè)到6株菌為意大利青霉。所開發(fā)特異引物均具高度準(zhǔn)確性和特異性。5.菌株DH-4對(duì)青綠霉的抑菌機(jī)理。為尋求更多的方法抑制柑橘青綠霉,本部分篩選出高效的拮抗細(xì)菌DH-4,經(jīng)16S r DNA方法鑒定為解淀粉芽孢桿菌。該菌表現(xiàn)出廣譜抗真菌性,尤其對(duì)青霉屬真菌以及其它園藝產(chǎn)品真菌病害。其發(fā)酵濾液在柑橘活體上表現(xiàn)出良好的綠霉病抑制性,濾液極其穩(wěn)定,在高溫、光照、揮發(fā)、不同p H值作用下仍然表現(xiàn)出明顯的抑菌性。運(yùn)用超高效液質(zhì)聯(lián)用(UPLC/ESI-MS)等方法,濾液中抗菌活性物質(zhì)被分為五類:大環(huán)內(nèi)酯類(Macrolactin)、多烯類(Bacillaene)、伊枯草菌素(Iturins)、表面活性素(Surfactin)和豐原素(Fengycin)。通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌可能的抑菌模式為:分泌抗菌活性物質(zhì)到體外,進(jìn)入指狀青霉細(xì)胞質(zhì),逐步破壞線粒體和液泡結(jié)構(gòu),使其空泡化、滲漏、紊亂等,從而抑制甚至殺死菌體。掃描電鏡觀察了明顯病斑以前的過程,濾液對(duì)孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)有明顯抑制作用。綜上研究結(jié)果,生防菌34-9和DH-4是從酵母和細(xì)菌的兩個(gè)角度來為柑橘采后真菌病害的防治提供理論、數(shù)據(jù)支撐和潛在的應(yīng)用價(jià)值。開發(fā)青綠霉病原菌特異性分子標(biāo)記亦可快捷高效地應(yīng)用于柑橘采后病原菌的檢測(cè)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S436.66;S476

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1425991