本文關(guān)鍵詞：鋅營(yíng)養(yǎng)對(duì)肉雞腸黏膜及Caco-2細(xì)胞腸上皮屏障功能的作用及機(jī)制　出處：《中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 鋅 鼠傷寒沙門(mén)氏菌 肉雞 Caco-2 腸黏膜屏障 GPR39

【摘要】：本研究主要通過(guò)4個(gè)試驗(yàn)來(lái)研究鋅對(duì)腸道黏膜屏障的影響及其機(jī)理。試驗(yàn)一研究早期鋅營(yíng)養(yǎng)對(duì)肉雞腸黏膜屏障功能的影響。試驗(yàn)選用1日齡健康雄性AA+雛雞600只,按照2×3因子隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),分成6個(gè)處理,每個(gè)處理10個(gè)重復(fù),研究添加不同時(shí)期的硫酸鋅分別為無(wú)鋅、全期添加鋅(35d添加),限期添加鋅(前14d添加硫酸鋅+后21d無(wú)鋅),鼠傷寒沙門(mén)氏菌(感染或不感染)以及他們的互作效應(yīng),其中鋅含量均為120mg/kg。試驗(yàn)期限為35d。沙門(mén)氏菌感染顯著降低0-21d(P0.05)平均體增重及平均料重比;提高了(P0.05)21d脾臟指數(shù)以及35d法氏囊及脾臟指數(shù);提高了(P0.05)21d血清內(nèi)毒素、FITC及回腸粘膜乳酸脫氫酶含量、促炎癥因子IL-1β及TNF-α的mRNA表達(dá)量;有提高TLR-4(P=0.073)的趨勢(shì);降低了(P=0.024)緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)。與無(wú)鋅相比,添加全期及限期硫酸鋅均能顯著提高0-21d(P=0.011)平均體增重,限期添加鋅降低了 0-21d料重比(P=0.02),提高了(P0.05)1L-1β、IL-10及ILR-4的mRNA表達(dá);全期添加鋅顯著降低了 21d血清內(nèi)毒素含量(P0.001),提高了(P0.05)IL-10及GPR39的mRNA表達(dá)量;全期及限期硫酸鋅的添加均能顯著提高(P=0.035)21d回腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1的mRNA表達(dá)。結(jié)果表明,肉雞早期日糧中添加硫酸鋅可促進(jìn)其后期生產(chǎn)性能的提高、免疫機(jī)能的激活以及緊密連接蛋白的表達(dá),與全期添加硫酸鋅無(wú)明顯區(qū)別,可替代全期添加硫酸鋅。試驗(yàn)二研究鋅通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體(GPR39)調(diào)節(jié)沙門(mén)氏菌感染Caco-2細(xì)胞屏障功能的機(jī)制。鋅已被證實(shí)能夠減緩鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)腸道屏障功能的損傷,但具體的細(xì)胞內(nèi)外相關(guān)機(jī)制還不清楚。本試驗(yàn)通過(guò)在transwell的培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞,構(gòu)建單層細(xì)胞腸上皮模型,采用小干擾RNA的方法預(yù)先沉默GPR39以及PKCζ基因,進(jìn)而添加不同濃度的鋅進(jìn)行預(yù)處理,最后感染鼠傷寒沙門(mén)氏菌,檢測(cè)腸上皮細(xì)胞的電阻值、通透性、緊密連接蛋白及信號(hào)分子GPR39、PKCζ的表達(dá),進(jìn)而探索信號(hào)分子GPR39及PKCζ在鋅調(diào)控腸道屏障功能中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),沙門(mén)氏菌感染顯著抑制了上皮細(xì)胞電阻值及緊密連接蛋白ZO-1及occludin的表達(dá)(P0.05),顯著提高了上皮通透性(P0.05),并降低了TLR 及PXCζ的mRNA表達(dá)及PKCζ的蛋白表達(dá)水平(P0.05)。50、100 μM的鋅顯著增加了電阻值,降低了腸道通透性及沙門(mén)氏菌的入侵?jǐn)?shù)量。100 μM鋅促進(jìn)了緊密連接蛋白ZO-1及occludin的表達(dá),并上調(diào)了 GPR39及PKCζ的表達(dá)。沉默GPR39基因時(shí),PKCζ的表達(dá)也同時(shí)受到抑制,抑制了鋅對(duì)腸道完整性的改善作用,主要表現(xiàn)為降低了感染沙門(mén)氏菌后細(xì)胞內(nèi)ZO-1及E-cadherin蛋白的表達(dá)。沉默PKCζ基因時(shí),抑制了鋅對(duì)ZO-1及E-cadherin蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用,但對(duì)GPR39的mRNA表達(dá)無(wú)顯著影響。因此,我們第一次證實(shí)了鋅通過(guò)GPR39激活了 PKCζ參與的緊密連接分子ZO-1及E-cadherin的表達(dá),進(jìn)而改善了沙門(mén)氏菌對(duì)腸道屏障功能的損傷。試驗(yàn)三研究鋅通過(guò)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)了 Caco-2細(xì)胞的腸道屏障功能。鋅具有維持腸道屏障功能及調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)識(shí)別和蛋白激酶的活性等重要功能。磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K)級(jí)聯(lián)信號(hào)具有調(diào)節(jié)細(xì)胞間完整性及緊密連接蛋白的作用。本試驗(yàn)主要是探索鋅是否能夠通過(guò)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路改善腸上皮緊密連接的完整性。Caco-2單層上皮細(xì)胞模型用0,50,100 μM鋅的DMEM作用特定時(shí)間點(diǎn)后,檢測(cè)上皮電阻、旁細(xì)胞通透性、細(xì)胞增值、分化、凋亡及自噬。與對(duì)照組相比,50,100 μM鋅作用6,12,24h均能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng),并促進(jìn)了 24h時(shí)細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)的表達(dá)。100μM鋅顯著提高了 6-24h的電阻值,減少了24h的通透性,上調(diào)了堿性磷酸酶活性以及ZO-1的表達(dá)。此外,100 μM鋅激活了 P-AKT及P-mTOR的表達(dá)。而PI3K抑制劑抵消了鋅對(duì)堿性磷酸酶、電阻值、ZO-1、P-AKT及P-mTOR的誘導(dǎo)和激活。此外,PI3K抑制劑促進(jìn)了上皮細(xì)胞通透性增加,提高了凋亡蛋白caspase-3及自噬蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)量�？傊�,鋅通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)了細(xì)胞分化以及緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá),進(jìn)而改善了腸道屏障功能。試驗(yàn)四研究日糧中添加不同來(lái)源的鋅對(duì)肉雞腸黏膜屏障功能的調(diào)節(jié)機(jī)制。試驗(yàn)選用1日齡健康雄性AA+雛雞600只,按照2×3因子隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),分成6個(gè)處理,每個(gè)處理10個(gè)重復(fù),研究添加不同來(lái)源的鋅分別為無(wú)鋅(0)、硫酸鋅(ZnSO4),蛋氨酸羥基類(lèi)似物螯合鋅(MHA-Zn),鼠傷寒沙門(mén)氏菌(感染或不感染)以及他們的互作效應(yīng),其中鋅含量均為120mg/kg。試驗(yàn)為21天。沙門(mén)氏菌感染顯著降低肉雞(P0.05)平均體增重及21日齡平均采食量,提高了 14日齡平均料重比(P0.001);對(duì)血液白細(xì)胞有增加的趨勢(shì)(P=0.059),提高了(P0.001)中性粒細(xì)胞以及單核細(xì)胞數(shù)量;降低了空腸絨毛高度與隱窩深度之比(P0.001);提高了(P0.05)血清D木糖含量、14日齡血清FITC及21日齡血清內(nèi)毒素含量;提高了(P0.05)14日齡回腸黏膜TNF-α、IL-8、IL-1β及緊密連接蛋白claudin-1RNA表達(dá);降低了 21日齡ZO-1的mRNA(P=0.002)表達(dá)。日糧中添加無(wú)機(jī)鋅及有機(jī)鋅均能顯著提高肉雞(P0.05)平均體增重及21日齡平均耗料量。無(wú)機(jī)及有機(jī)鋅均能降低14日齡血清中D木糖含量(P=0.001)。硫酸鋅降低了(P0.05)21日齡血清FITC含量及14日齡claudin-1 mRNA的表達(dá),有降低14日齡血清內(nèi)毒素含量的趨勢(shì)(P=0.064);提高了 21日齡ZO-1(P=0.009)及信號(hào)分子GPR39(P=0.046)的mRNA表達(dá)。有機(jī)鋅顯著降低了(P=0.006)21日齡回腸黏膜TNF-α的mRNA表達(dá),提高了(P0.05)IL-1β、IL-10及TLR-4的mRNA表達(dá)。此外,感染沙門(mén)氏菌與鋅對(duì)中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞數(shù)量、空腸絨毛高度、21日齡回腸黏膜IL-1β及IL-10的mRNA表達(dá)量有顯著互作效應(yīng),即在感染沙門(mén)氏菌條件下,無(wú)機(jī)鋅與有機(jī)鋅均能顯著降低(P0.05)血液中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞數(shù)量,降低空腸絨毛高度(P=0.003);有機(jī)鋅顯著提高了IL-1β及IL-10的mRNA水平。結(jié)果表明,有機(jī)鋅及無(wú)機(jī)鋅均能夠有效改善感染沙門(mén)氏菌肉雞生產(chǎn)性能及腸道形態(tài)結(jié)構(gòu),無(wú)機(jī)硫酸鋅可改善腸道屏障的完整性,表現(xiàn)為降低腸道通透性,提高緊密連接的表達(dá)。有機(jī)鋅可激活機(jī)體免疫機(jī)能,對(duì)腸道完整性無(wú)改善作用。綜上所述,肉雞早期日糧中添加硫酸鋅可促進(jìn)其后期生產(chǎn)性能的提高、免疫機(jī)能的激活以及緊密連接蛋白的表達(dá),可替代全期添加硫酸鋅。體外試驗(yàn)表明硫酸鋅改善了沙門(mén)氏菌對(duì)腸上皮屏障功能的機(jī)制是通過(guò)GPR39激活了 PKCζ參與的緊密連接分子ZO-1及E-cadherin的表達(dá)。此外,硫酸鋅還可通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)了細(xì)胞分化以及緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)。通過(guò)對(duì)比無(wú)機(jī)硫酸鋅,有機(jī)蛋氨酸羥基類(lèi)似物螯合鋅也可有效改善肉雞生產(chǎn)性能并激活機(jī)體及腸黏膜的免疫機(jī)能,對(duì)肉雞腸黏膜屏障功能無(wú)明顯改善作用。
[Abstract]:The effects of zinc on intestinal mucosal barrier function were studied by means of four experiments . The effect of early zinc nutrition on intestinal mucosal barrier function was studied . The expression of ZO - 1 and E - cadherin in intestinal barrier was studied . The expression of IL - 1尾 , IL - 10 and IL - 10 in serum of 21 - day - old were significantly decreased ( P = 0.064 ) . The results showed that zinc sulfate could improve the expression of IL - 1尾 and IL - 10 in serum of 14 - day - old .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S831.5

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本文編號(hào)：1420785