本文關(guān)鍵詞：基于離體模式體系的百合小鱗莖發(fā)生發(fā)育機(jī)制研究　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：球根花卉,也稱(chēng)為觀賞地下芽植物(Ornamental geophytes),在全球花卉產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要地位,可應(yīng)用于切花、盆花及庭院用花。然而,因種球較低的自然繁殖率及較長(zhǎng)的童齡期,導(dǎo)致球根花卉新品種育種周期較長(zhǎng),例如,百合約12～15年,郁金香則需20～30年。鱗莖等必須大于某一臨界大小時(shí)才能滿(mǎn)足植株開(kāi)花的要求,且大球常意味著更高的開(kāi)花品質(zhì)。因此,如何加速育種周期,縮短"童齡期"(即幼年鱗莖到成年鱗莖的時(shí)間),形成高品質(zhì)開(kāi)花球,解決其發(fā)生發(fā)育問(wèn)題尤為重要,這對(duì)加快育種周期,推動(dòng)我國(guó)球根花卉種球國(guó)產(chǎn)化具重要意義。本文以百合(Lilium)為試材,在構(gòu)建浙江省野生百合離體快繁體系基礎(chǔ)上,建立了以東方百合'索邦'(L.Oriental Hybrids 'Sorbonne')為主要研究對(duì)象的離體模式研究體系,采用外源植物生長(zhǎng)添加物質(zhì)系統(tǒng)研究了鱗莖發(fā)育生理生化機(jī)制,同時(shí)建立了外源正負(fù)向調(diào)控轉(zhuǎn)錄組及表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù),并克隆了 一個(gè)淀粉合成代謝關(guān)鍵基因LohAGPS1,最后探討了一種可用于鱗莖發(fā)育生物學(xué)研究的天然突變體巨球百合(L.brownii.E.Brown ex Miellez var.giganteum G.Y.LiZ.H.Chen),主要研究結(jié)果如下:1.百合屬植物組織培養(yǎng)及東方百合'索邦'離體研究模型建立(1)湖州百合(L.lancifolium Thunb)鱗片經(jīng)4℃冷藏2周后置于200～300 mg/L甲基托布津中震蕩0.3～1 h,70～75%酒精中浸泡20～30 s,再浸入含1～2滴吐溫-20,質(zhì)量體積濃度為0.1%～0.2%。升汞中15～25 min,通過(guò)甲基托布津-酒精-升汞三步消毒法建立無(wú)菌體系,污染率為24.23%,死亡率為19.14%。鱗片的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L,平均誘導(dǎo)率為54.55%,可獲得4.8個(gè)不定芽;出芽后,轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基(6-BA1.5mg/L + NAA0.1mg/L)進(jìn)行增殖培養(yǎng),獲得叢生芽,增殖系數(shù)為265%。(2)藥百合(L.speciosum Thunb.var.gloriosoide.s Baker)種子萌發(fā)最佳培養(yǎng)基為 MS+ 6-BA1.0mg/L + NAA0.1mg/L,萌發(fā)率為83.3%,誘導(dǎo)率為88.9%,平均誘導(dǎo)不定芽數(shù)達(dá)2.5個(gè);92%以上種子屬于子葉出土型;未經(jīng)剝皮處理的種子在任何培養(yǎng)基上都無(wú)法萌動(dòng);未剝皮處理污染率為5%,而剝皮處理低至0;種子萌發(fā)試管苗染色體倍性為2n=2x=24,未發(fā)生遺傳變異。(3)以材料易獲得,研究較多的東方百合'索邦'為試材,2%NaClO處理鱗片6min,污染率為0,死亡率為15.2%;最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS + 6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L,平均誘導(dǎo)率為57.6%且平均誘導(dǎo)芽數(shù)為6.9個(gè)。隨后,將材料放于僅含70 g/L蔗糖及8 g/L瓊脂的MS基本培養(yǎng)基進(jìn)行增殖壯球培養(yǎng),直至獲得足量并來(lái)自同一母體材料、生理生化狀態(tài)一致性高的離體小鱗莖。取直徑5～8 mm離體小鱗莖接種于上述最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,培養(yǎng)35 d獲得大量芽,篩選芽長(zhǎng)1～2 cm,基部直徑3～5 mm的單芽用于后續(xù)試驗(yàn),從而建立了發(fā)育生物學(xué)問(wèn)題研究的離體模式體系,具均一性強(qiáng),可控等優(yōu)勢(shì)。芽誘導(dǎo)過(guò)程可分為細(xì)胞脫分化階段、生長(zhǎng)錐形成階段、葉原基形成階段及芽形成階段,這是關(guān)于離體芽誘導(dǎo)過(guò)程的首次完整報(bào)道。芽的形成為外起源,成熟鱗片中維管束平行分布于薄壁細(xì)胞中,并于鱗片尖端匯合,其維管束類(lèi)型為有限維管束。在芽形成過(guò)程中,細(xì)胞中淀粉運(yùn)輸方向大致為從頂部至基部,從鱗片外側(cè)向內(nèi)側(cè),循環(huán)往復(fù),以供應(yīng)鱗片基部近軸端新芽形成所需的物質(zhì)與能量。2.外源添加物質(zhì)對(duì)'索邦'離體百合發(fā)育的影響及其生理生化機(jī)制(1)在離體條件下,外源PBZ處理對(duì)植株地上部分及根產(chǎn)生抑制,且濃度越高,抑制效果越明顯,當(dāng)濃度為5×10-2mM時(shí),葉片數(shù)接近0,根數(shù)僅1.3。相應(yīng)地,隨PBZ濃度升高,相對(duì)鱗莖重量顯著升高,最高達(dá)100%。LPBZ處理下,其鱗莖鮮重及直徑最佳,75 DAT時(shí),分別為396 mg及10.7 mm,為對(duì)照的2.5倍及1.6倍,相對(duì)鱗莖重量在69.86～85.38%間,地上及地下部分均衡生長(zhǎng),在培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)消耗殆盡時(shí),仍可保證葉片光合產(chǎn)物向鱗莖的運(yùn)輸。PBZ處理可促進(jìn)小鱗莖中碳水化合物積累,處理濃度越高,積累效應(yīng)越明顯。多效唑?qū)Φ矸酆铣傻拇龠M(jìn)作用一方面是由于GBSS酶活性的增加,從而導(dǎo)致直鏈淀粉的合成,另一方面則是在碳饑餓時(shí)(60 DAT),有效增強(qiáng)淀粉合成相關(guān)酶活性,其中,LPBZ下AGPase在整個(gè)發(fā)育期活性較高,表明ADPG底物供應(yīng)充足。外源PBZ處理在膨大初期促進(jìn)IAA含量,暗示PBZ有利于發(fā)育早期細(xì)胞的分裂與膨大�？寡趸阁w系中APX,CAT及GR高活性可能和清除15 DAT前用于松弛及軟化細(xì)胞產(chǎn)生的ROS,確保有機(jī)體內(nèi)ROS維持在低水平、穩(wěn)定平衡的生理含量。(2)外源HA處理(0.2 mg/L～20 mg/L)可顯著提高離體小鱗莖的鮮重,其重量最終分為對(duì)照的2.9倍,1.8倍及1.8倍,且低濃度效果最佳,在75 DAT時(shí)鱗莖鮮重為468 mg,鱗莖直徑為11.68 mm,鱗莖大小為933.17 mm3。中高濃度HA處理對(duì)于植株地上部分(包括株高及葉片數(shù))促進(jìn)作用明顯,但抑制根生長(zhǎng),LHA則利于根發(fā)育,根數(shù)最多為14.5,根長(zhǎng)最長(zhǎng)達(dá)5.75 cm。隨著HA處理濃度升高,相對(duì)鱗莖重量逐漸降低,從而打破庫(kù)-源平衡。HA可促進(jìn)百合小鱗莖蔗糖、可溶性糖及淀粉等含量,且濃度越高,促進(jìn)作用越明顯。LHA處理下關(guān)鍵淀粉合成酶活性較高,而中高濃度HA處理下則在30 DAT時(shí)出現(xiàn)增高,且以AGPase及SSS為主,表明淀粉積累主要來(lái)自于支鏈淀粉合成。腐植酸處理并不能增加 iPA,ZR,ABA及IAA等鱗莖發(fā)育促進(jìn)型激素的水平。然而,LHA處理下其GA含量顯著低于其它處理,提高了整個(gè)鱗莖膨大過(guò)程中促進(jìn)型激素/抑制型激素的比值,利于光合產(chǎn)物從芽向地下庫(kù)器官轉(zhuǎn)運(yùn)。與之相反地,中高濃度處理下HA赤霉素水平高,這可能與其旺盛的地上部分生長(zhǎng)相關(guān)。LHA處理還顯著提高了 SOD,POD,APX,CAT及GR在發(fā)育早期活性,其可能用于清除活性氧以保持細(xì)胞穩(wěn)定。(3)外源CPPU處理對(duì)于'索邦'百合試管鱗莖形成影響差異明顯,結(jié)鱗莖率隨處理濃度上升而下降,當(dāng)濃度為5×10-2mM時(shí),結(jié)鱗莖率為0%,此時(shí),形成基部腫脹無(wú)鱗片且相對(duì)幼嫩的類(lèi)芽假鱗莖。在中低濃度下CPPU處理可促進(jìn)地上部株高及葉片生長(zhǎng),而高濃度則不利于其生長(zhǎng),所有CPPU處理均表現(xiàn)出對(duì)根系的抑制效應(yīng)。CPPU處理可通過(guò)增強(qiáng)鱗莖對(duì)光合產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)能力,從而同化物從葉片中的輸出率及在鱗莖中的分配率均增多,即增加庫(kù)強(qiáng),因而鱗莖中蔗糖等可溶性總糖含量隨CPPU處理濃度上升而升高,然而HCPPU由于葉片畸形較少進(jìn)行光合作用,積累偏低。CPPU總體上可促進(jìn)淀粉合成關(guān)鍵酶AGPase,GBSS及SSS等活性,但淀粉含量卻顯著低于對(duì)照,推測(cè)是由于CPPU在促進(jìn)鱗莖淀粉合成同時(shí)促進(jìn)了小顆粒淀粉的降解,其中HCPPU整個(gè)發(fā)育過(guò)程淀粉平均含量為52.37 mg/g FW。CPPU處理減少了鱗莖發(fā)育過(guò)程中內(nèi)源CTKs水平,而對(duì)于ABA及IAA有促進(jìn)效果,且IAA含量與CPPU處理濃度呈線性關(guān)系。HCPPU處理下ABA/GA及IAA/GA的比值在發(fā)育過(guò)程中前者不斷升高而后者不斷下降,同時(shí),其峰值在所有處理中最高,暗示其特殊的生理狀態(tài),并可能與鱗莖無(wú)法成球直接或間接相關(guān)。CPPU處理總體上促進(jìn)抗氧化體系相關(guān)酶活性,在45 DAT時(shí),對(duì)于HCPPU,所有的激素及幾乎所有抗氧化酶均出現(xiàn)峰值,這是否為HCPPU前期30%鱗莖形成率而終期鱗莖形成率為0%的轉(zhuǎn)折點(diǎn),還需進(jìn)一步研究。(4)以最佳促進(jìn)型處理LHA(0.2mg/L)、LPBZ(5×10-4mM)為標(biāo)準(zhǔn),去除培養(yǎng)基中蔗糖,比較不添加蔗糖的最佳外源處理是否仍起作用。結(jié)果表明,HA及PBZ可部分表現(xiàn)其特性,如PBZ的株控作用,HA對(duì)葉片及根系的促進(jìn)作用。LHA-SF葉片數(shù)達(dá)15.5,而LPBZ-SF則為4.2,對(duì)照為9.7,分別為添加蔗糖處理的4.85、1.75及4.43倍;三者相對(duì)鱗莖鮮重平均值僅為50.32%,而添加蔗糖處理則高達(dá)75.97%;處理60天時(shí),LHA-SF及LpBZ-SF鱗莖鮮重分別僅為88 mg及82 mg。以上結(jié)果表明,蔗糖的添加對(duì)于離體條件下鱗莖發(fā)育必不可少,地上部分過(guò)旺生長(zhǎng)及根系的不良發(fā)育是外在原因,引發(fā)源庫(kù)失衡,而蔗糖則可能同時(shí)起了碳源及信號(hào)分子作用,調(diào)控百合植株光合產(chǎn)物流的方向及相關(guān)代謝途徑。3.離體小鱗莖發(fā)生發(fā)育的分子調(diào)控路徑及關(guān)鍵基因挖掘分析(1)基于Illumina HiSeq2000測(cè)序平臺(tái)采用RNA-Seq首次報(bào)道了百合離體條件下的轉(zhuǎn)錄組背景信息。拼接獲得64,794條unigene,平均長(zhǎng)度為776 bp,序列總大小約50 Mb,約占百合全基因組的0.14%。利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)共注釋33,255個(gè)unigene,約占所有轉(zhuǎn)錄本的51.32%。采用MISA軟件共檢測(cè)到2,732條潛在SSR位點(diǎn),并以三核苷酸重復(fù)基元序列最多。在KEGG途徑中,重點(diǎn)分析了碳水化合物及激素代謝路徑,表明其在鱗莖發(fā)育中可能發(fā)揮的重要作用。。bHLH及ERFs轉(zhuǎn)錄因子家族對(duì)鱗莖的發(fā)生及發(fā)育可能較為關(guān)鍵。此外,LHCb轉(zhuǎn)錄本的高表達(dá)暗示鱗莖可能也參與光合作用,故因重新審視離體百合庫(kù)-源關(guān)系。(2)以HCPPU(不結(jié)鱗莖型)、LPBZ(鱗莖促進(jìn)型)及對(duì)照(正常結(jié)鱗莖型)建立三個(gè)轉(zhuǎn)錄譜文庫(kù),共獲得3,663個(gè)差異表達(dá)基因,包括6種表達(dá)模式和聚類(lèi)。光合作用中捕光色素蛋白復(fù)合體LHCB6、LHCA4在CON、LPBZ高表達(dá)而早期光誘導(dǎo)蛋白(ELIPs)在HCPPU中表達(dá)量高。與生長(zhǎng)素相關(guān)的AVP1基因及谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶GST在鱗莖形成類(lèi)型中高表達(dá),而生長(zhǎng)素早期響應(yīng)蛋白CH3、茉莉酸途徑的轉(zhuǎn)錄抑制因子JAZ可能與HCPPU鱗莖形成失敗相關(guān);細(xì)胞分裂素氧化酶CKX在HCPPU中大量特異性表達(dá),暗示細(xì)胞分裂素很可能是重要原因之一,而又以玉米素ZT為最關(guān)鍵的CTKs。氧化還原過(guò)程及氧化應(yīng)激過(guò)程則很有可能參與調(diào)控鱗莖發(fā)生發(fā)育中抗氧化酶清除活性氧的過(guò)程。蔗糖合酶SUS3在HCPPU中相比LPBZ表達(dá)量更高,暗示碳水化合物(尤其是淀粉)積累不足是HCPPU鱗莖無(wú)法形成的直接體現(xiàn)。(3)改良CTAB法最適于百合離體小鱗莖RNA的提取,樣品質(zhì)量可滿(mǎn)足后續(xù)基因克隆等試驗(yàn)。通過(guò)RACE技術(shù),首次報(bào)道了全長(zhǎng)l,929bp的東方百合'索邦'LohAGPS1(GenBank登錄號(hào):KX398951),其中開(kāi)放閱讀框l,569 bp,編碼522個(gè)氨基酸;所編碼的氨基酸序列包含底物ATP結(jié)合位點(diǎn),催化位點(diǎn),底物G-1-P結(jié)合位點(diǎn),激活因子3-PGA結(jié)合位點(diǎn)等保守結(jié)構(gòu)域。4.巨球百合——可能用于鱗莖發(fā)育研究的天然突變體使用0.1%HgCl2處理巨球百合鱗片8min,污染率為40.00%。當(dāng)培養(yǎng)基中含1.5mg/L 6-BA及0.5 mg/LNAA時(shí),芽誘導(dǎo)效果較佳,誘導(dǎo)率為100.00%,平均誘導(dǎo)芽數(shù)為5.0個(gè),芽健壯。巨球百合鐵的含量為5.84mg/100g,硒元素含量高達(dá)0.014μg/kg,為卷丹百合的2.92倍,顯示出較高的食用價(jià)值,甚至可考慮作為設(shè)計(jì)功能性食品(保健食品)的原料。巨球百合具鱗莖巨大的特點(diǎn),作為天然突變體可用于挖掘控制鱗莖發(fā)育的相關(guān)調(diào)控基因。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S682.29
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本文編號(hào)：1419140