本文關(guān)鍵詞：番鴨細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白B細(xì)胞抗原表位的篩選及應(yīng)用　出處：《東北林業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：番鴨(Cairna moschata),又稱疣鼻棲鴨,屬于棲鴨類。華盛頓公約(CITES)將其野生種群列入附錄三物種。野生番鴨棲息于熱帶地區(qū),目前,在墨西哥、巴西和巴拉圭等國(guó)有其野生種群。因?yàn)榉喚哂休^大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,其人工飼養(yǎng)數(shù)量逐年不斷增加。番鴨細(xì)小病毒病是由番鴨細(xì)小病毒(Muscovy duck parvovirus, MDPV)引起,以1-3周齡雛番鴨為易感的一種急性傳染性、高死亡率的病毒病。耐過(guò)鴨往往生長(zhǎng)發(fā)育遲緩,成為僵鴨,失去其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。該病呈世界范圍分布,給番鴨養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。MDPV只有一個(gè)血清型,從世界各地分離的病毒儀有微小差異。番鴨感染MDPV后,主要以體液免疫反應(yīng)為主。B細(xì)胞抗原表位決定著機(jī)體產(chǎn)生抗體的特異性,是誘導(dǎo)體液免疫的基本單位。但至今國(guó)內(nèi)外對(duì)MDPV蛋白的B細(xì)胞抗原表位知之甚少。病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白是在病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的,感染動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生抗非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體,而滅活疫苗或亞單位疫苗免疫的動(dòng)物不會(huì)產(chǎn)生針對(duì)病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體。因此可以利用非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的存在與否來(lái)區(qū)分滅活疫苗免疫動(dòng)物和自然感染動(dòng)物。為了對(duì)MDPV YL08株NS1蛋白(氨基酸序列全長(zhǎng)627 aa)進(jìn)行抗原表位作圖,本研究設(shè)計(jì)了一套覆蓋整個(gè)NSl蛋白的短肽,這些短肽長(zhǎng)為30個(gè)氨基酸左右,有10個(gè)氨基酸重疊。為了表達(dá)這些短肽,共設(shè)計(jì)合成了31對(duì)互補(bǔ)的寡核苷酸片段。每對(duì)寡核苷酸片段5’端磷酸化。上述寡核苷酸片段退火后,插入至原核表達(dá)載體pET-32a中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了相應(yīng)重組蛋白的表達(dá)。利用切膠純化的方法對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行了純化。純化蛋白經(jīng)抗His單克隆抗體鑒定。應(yīng)用MDPV YL08株人工感染番鴨血清對(duì)表達(dá)的31個(gè)重組蛋白的抗原性進(jìn)行了檢測(cè),Western blot結(jié)果表明,表達(dá)的融合蛋白NS (481-510)、NS (501-530)、NS (521-550)、NS (541-570)、NS (561-590)、NS (581-610)和NS(601-627)能被MDPV感染血清所識(shí)別,而其他融合蛋白不能被MDPV感染血清所識(shí)別。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果,MDPV YL08株NS1蛋白的B細(xì)胞線性抗原表位區(qū)位于NS1蛋白的羧基末端481-627 aa。Dot-ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明融合蛋白NS(501-530)的抗原性最強(qiáng)。以純化的融合蛋白NS(501-530)為包被抗原建立了間接ELISA檢測(cè)方法。確定了滅活疫苗免疫番鴨和自然感染番鴨的臨界值為0.300。對(duì)240份陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè),陽(yáng)性符合率為100%。對(duì)100份陰性血清進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果為：30份健康番鴨血清中有1份的檢測(cè)值略高于臨界值；70份滅活疫苗免疫血清中有1份的檢測(cè)值略高于臨界值,檢測(cè)準(zhǔn)確率為98.0%。本研究建立的ELISA檢測(cè)方法與鴨瘟病毒(Duck plague virus, DPV),鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus, DHV)和鴨呼腸孤病毒(duck reovirus, DRV)等陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明,該ELISA檢測(cè)方法的敏感性優(yōu)于中和實(shí)驗(yàn)。ELISA的板內(nèi)及板間變異系數(shù)均小于10%,重復(fù)性較好。對(duì)含有抗原表位NS(501-530)的重組蛋白抗體消長(zhǎng)規(guī)律分析表明,重組蛋白抗體在番鴨感染MDPV后第1周即可檢測(cè)到,第3周達(dá)到最高峰,以后效價(jià)開始略有下降,一直可持續(xù)到第12周。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可證明該ELISA檢測(cè)方法可應(yīng)用于MDPV滅活疫苗免疫番鴨和MDPV自然感染番鴨的鑒別診斷。本研究建立的基于NS蛋白抗原表位的ELISA檢測(cè)方法,為MDPV的快速診斷、疫情監(jiān)測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查和免疫抗體效價(jià)測(cè)定提供了一定的技術(shù)支持。特別為將來(lái)使用滅活疫苗(或重組結(jié)構(gòu)蛋白亞單位疫苗)免疫番鴨時(shí)鑒別自然感染番鴨與疫苗免疫番鴨奠定了一定的技術(shù)儲(chǔ)備。
[Abstract]:This study designed a set of short peptides covering the whole NSl protein . The results showed that the sensitivity of the ELISA assay was 0 . 300 . The results showed that the detection accuracy of the recombinant protein NS ( 501 - 530 ) was 0 . 300 . The results showed that the ELISA assay was applied to the differential diagnosis of MDPV . The results showed that the ELISA assay could be applied to the differential diagnosis of duck plague virus ( MDPV ) and duck reovirus .

【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1409851