本文關鍵詞：小麥TaRCR1和TaAGC1基因在防御紋枯病反應中的功能與作用機制研究　出處：《中國農(nóng)業(yè)科學院》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：近年來,由于氣候變暖、耕作制度和種植密度的改變,由禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的小麥紋枯病(wheat sharp eyespot),已發(fā)展為我國主要的病害,連續(xù)十多年發(fā)病面積超過一億畝,損失嚴重。生產(chǎn)上抗紋枯病小麥品種匱乏,因此分離克隆抗紋枯病相關基因,研究其功能和作用機制,為抗紋枯病小麥育種提供基因和理論支撐,具有重要意義。NB-LRR類蛋白和蛋白激酶是植物抗病反應中兩種重要的蛋白。本研究主要以紋枯病誘導的一個小麥NB-LRR類蛋白編碼基因TaRCR1和一個蛋白激酶基因TaAGC1過表達的小麥和沉默表達的小麥為實驗材料,研究了這兩個基因在小麥抗紋枯病反應中功能和作用機制。TaRCR1編碼NB-LRR類蛋白,參與小麥對紋枯病菌的防御反應。本研究繼續(xù)對TaRCR1基因的分子生物學特性、抗病功能和作用機制進行了研究,主要結(jié)果如下:(1)TaRCR1受紋枯菌誘導表達,在接種紋枯菌7天后達到表達高峰,并且在根和莖中的表達量高于葉和穗中的表達量。(2)利用PEG介導GFP-TaRCR1融合蛋白在小麥原生質(zhì)體中瞬時表達,進行亞細胞定位分析,結(jié)果顯示TaRCR1分布于小麥的胞質(zhì)和細胞核中。(3)利用PCR、q RT-PCR和Westernblot技術,對轉(zhuǎn)Ta RCR1基因小麥T2-T4代植株進行轉(zhuǎn)基因分子特征分析,結(jié)果表明,在6個轉(zhuǎn)基因小麥株系中轉(zhuǎn)入的TaRCR1能夠遺傳、轉(zhuǎn)錄和過量表達;對TaRCR1過表達轉(zhuǎn)基因小麥株系和未轉(zhuǎn)基因小麥揚麥16(受體)接種紋枯菌進行抗病性鑒定,結(jié)果表明TaRCR1基因的過表達提高了小麥對紋枯病的抗性。(4)應用大麥條紋花葉病毒(barley stripe mosaic virus,BSMV)誘導的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技術,摩擦接種BSMV:TaRCR1病毒,以沉默抗紋枯病小麥CI12633中TaRCR1基因的表達,再接種紋枯病菌進行抗病程度分析,結(jié)果說明TaRCR1基因表達量的降低,減弱了寄主小麥對紋枯病的抗性。(5)利用qRT-PCR分析14個防御相關基因在TaRCR1基因過表達小麥和受體揚麥16以及Ta RCR1基因表達沉默和對照小麥植株中的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果表明Ta RCR1正向調(diào)控PR1、PR2、chitinase2和Ta PIE1的表達水平,這四個防御相關基因的表達還受紋枯菌的誘導。(6)H_2O_2和茉莉酸(jasmonic,JA)處理誘導Ta RCR1基因的表達水平,且H_2O_2預處理可以提高紋枯菌侵染對Ta RCR1基因的誘導表達水平;Ta RCR1所調(diào)控的PR1、PR2、chitinase2和Ta PIE1基因也受H_2O_2的誘導表達。(7)接種紋枯菌12 h后,Ta RCR1正向調(diào)控CAT1、POX2等活性氧(reactive oxygen species,ROS)清除相關基因的轉(zhuǎn)錄表達以及過氧化物酶(peroxidase,POD)的活性,負向調(diào)控ROS合成關鍵基因NOX的轉(zhuǎn)錄表達;DAB和NBT染色結(jié)果顯示,Ta RCR1基因過量表達減弱了紋枯菌侵染引起的ROS積累;對轉(zhuǎn)Ta RCR1基因小麥噴施POD合成的抑制劑Na N3降低了Ta RCR1過表達植株對紋枯病的抗性,說明小麥體內(nèi)ROS的動態(tài)平衡對于Ta RCR1介導的紋枯病抗性非常重要,Ta RCR1通過調(diào)控ROS相關基因的表達維持ROS的動態(tài)平衡,進而正向調(diào)控小麥對紋枯病的抗性反應。(8)利用Anti-c-Myc Agarose純化Ta RCR1過表達小麥體內(nèi)總蛋白,用胰蛋白酶進行酶解處理后進行質(zhì)譜分析,篩選到一個Ta RCR1互作蛋白Ta PP2Ac,酵母雙雜交實驗證明Ta RCR1與Ta PP2Ac相互作用;BSMV-VIGS實驗證明,Ta PP2Ac的表達沉默提高了小麥對紋枯病的抗性;同時,Ta PP2Ac的q RT-PCR分析結(jié)果顯示,Ta PP2Ac在Ta RCR1過表達小麥中的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于受體小麥,而在Ta RCR1基因表達沉默小麥植株中的表達水平顯著高于對照植株中,推測Ta RCR1通過負調(diào)控Ta PP2Ac基因的表達水平提高小麥對紋枯病的抗性。本課題組前期研究表明,一個小麥蛋白激酶基因TaAGC1的過量表達可以顯著增強轉(zhuǎn)基因小麥對紋枯病的抗性反應,而該基因的表達沉默削弱了小麥對紋枯病的抗性。本文對TaAGC1抗紋枯病作用的機制進行了研究,取得以下結(jié)果:(1)TaAGC1響應H_2O_2的脅迫,H_2O_2處理后TaAGC1基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高且在處理后3h達到表達高峰,這暗示TaAGC1基因可能參與H_2O_2信號轉(zhuǎn)導路徑。(2)DAB和NBT染色結(jié)果顯示,紋枯菌的侵染誘導小麥植株產(chǎn)生大量的ROS(H_2O_2和O2-),TaAGC1基因過表達可以降低紋枯菌侵染引起的過量ROS的積累水平。qRT-PCR分析結(jié)果表明ROS消除相關基因POX2、CAT1和SOD3在Ta AGC1過表達株系中的表達量顯著上調(diào),而其在TaAGC1沉默表達植株中的表達量明顯降低;ROS合成關鍵基因NOX的表達模式與以上3個基因的相反,即在TaAGC1過表達中表達量最低,在TaAGC1沉默表達植株中的表達量最高。(3)ns LTP1、defensin、chitinase2和PR10等防御標記基因的表達受紋枯菌誘導;TaAGC1正向調(diào)控nsLTP1和defensin的表達,而負向調(diào)控chitinase2和PR10的表達。由此可知,TaAGC1作為一個正向調(diào)節(jié)因子,通過調(diào)控ROS相關基因和防御基因的表達介導小麥對紋枯病的抗性反應。
[Abstract]:In recent years , due to the changes of climate warming , cropping system and planting density , wheat sheath blight caused by Fusarium cerealis has been developed as the main disease in China . The results showed that the expression of TaRCR1 gene was higher than that in leaves and ears . The results showed that the expression of TaRCR1 gene was higher than that in leaf and ear . ( 4 ) The expression of TaRCR1 gene in wheat CI12633 induced by barley stripe mosaic virus was studied . The results showed that the expression level of TaRCR1 gene was decreased and the expression level of TaRCR1 gene was reduced . The results showed that the expression of TaRCR1 gene was decreased and the expression level of Ta RCR1 gene was decreased . ( 7 ) After 12 hours of inoculation , the expression of reactive oxygen species ( ROS ) , such as CAT1 , POX2 and other reactive oxygen species ( ROS ) , was positively regulated by Ta RCR1 . The expression of ROS was negatively regulated by reactive oxygen species ( ROS ) . ( 1 ) The expression level of TaAGC1 gene TaAGC1 was significantly higher than that in control plants . ( 3 ) The expression of defensive marker genes , such as ns LTP1 , deferent , chitinase2 and PR10 , was induced by stridicum ; TaAGC1 regulates the expression of nsLTP1 and deferent and negatively regulates the expression of chitinase2 and PR10 . Thus , TaAGC1 serves as a positive regulation factor to mediate the resistance of wheat to sheath blight by regulating the expression of ROS - related genes and defense genes .

【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S435.121.4

【參考文獻】

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1 蔡士賓;任麗娟;顏偉;吳紀中;陳懷谷;吳小有;張仙義;;小麥抗紋枯病種質(zhì)創(chuàng)新及QTL定位的初步研究[J];中國農(nóng)業(yè)科學;2006年05期

2 任麗娟,蔡士賓,湯，

本文編號：1405365