本文關(guān)鍵詞：雞干擾素刺激基因IFIT5和Viperin在IBDV感染宿主細(xì)胞中的作用機(jī)制研究　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：傳染性法氏囊病是一種危害3-6周齡雛雞的急性、高度接觸性傳染疾病,該病的病原傳染性法氏囊病病毒(IBDV)主要攻擊法氏囊中未成熟的B淋巴細(xì)胞,造成雞嚴(yán)重的免疫抑制。IBDV是一種雙股雙節(jié)段RNA病毒,其基因組包括A、B兩個(gè)節(jié)段,編碼VP1～VP5五種病毒蛋白。IBDV感染會(huì)影響干擾素刺激基因(Interferon Stimulated Genes,ISGs)的表達(dá),但目前針對(duì)IBDV與ISG之間關(guān)系的研究還較少。本課題以兩個(gè)IBDV感染時(shí)上調(diào)的ISGs(IFIT5和Viperin)作為研究對(duì)象,分析了其在IBDV感染過(guò)程中的作用。IFIT5是雞IFIT家族的唯一成員,本實(shí)驗(yàn)室前期的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)表明,在IBDV感染的DF-1細(xì)胞中IFIT5呈上調(diào)表達(dá),但目前該基因在Genbank中仍處于預(yù)測(cè)狀態(tài),未見有關(guān)該基因的功能報(bào)道。本研究從IBDV感染的DF-1細(xì)胞中克隆了雞IFIT5基因,其全長(zhǎng)為1440bp,編碼480個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示其具有IFIT家族蛋白共有的六個(gè)典型TPR結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析顯示,雞IFIT5與火雞IFIT5的氨基酸同源性最高,與魚類的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。應(yīng)用原核表達(dá)的雞IFIT5蛋白制備的多克隆抗體,我們證明poly(I:C)、IFN-α和IFN-β均可在基因和蛋白水平誘導(dǎo)雞IFIT5表達(dá),并證實(shí)IFIT5與Mda5之間的相互作用。另外,干擾雞IFIT5能夠抑制IFN-β的產(chǎn)生。為研究雞IFIT5與IBDV感染的關(guān)系,我們對(duì)IBDV感染后雞IFIT5的動(dòng)態(tài)表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,IBDV感染確實(shí)能夠引起雞IFIT5在體內(nèi)外上調(diào)表達(dá),且呈IBDV感染劑量依賴性。進(jìn)一步對(duì)IBDV的各編碼蛋白及基因組進(jìn)行過(guò)表達(dá)并檢測(cè)雞IFIT5的變化,發(fā)現(xiàn)引起雞IFIT5上調(diào)的病毒因子是病毒蛋白VP1和病毒基因組dsRNA。然而,無(wú)論過(guò)表達(dá)還是干擾雞IFIT5,IBDV的病毒蛋白及病毒滴度均無(wú)明顯變化,說(shuō)明雞IFIT5沒有影響IBDV的復(fù)制,同時(shí)也提示IBDV可能以某種機(jī)制逃逸了 IFIT5的抗病毒作用。作為另一個(gè)具有抗病毒活性的ISG,Viperin在IBDV感染后也會(huì)被刺激上調(diào)。在此我們也對(duì)Viperin進(jìn)行了過(guò)表達(dá),并分析其對(duì)IBDV復(fù)制的影響。與IFIT5相似,雞Viperin并不影響IBDV在DF-1細(xì)胞中復(fù)制,但人Viperin卻能顯著抑制IBDV在293T細(xì)胞的復(fù)制。進(jìn)一步究其原因,我們發(fā)現(xiàn)Viperin對(duì)細(xì)胞自噬水平無(wú)影響,但可以增強(qiáng)293T細(xì)胞的凋亡,因此推測(cè)Viperin可能是通過(guò)誘導(dǎo)凋亡來(lái)限制IBDV在293T細(xì)胞復(fù)制。除先天免疫外,細(xì)胞自噬也是機(jī)體對(duì)抗病毒感染的一條途徑,但長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化使病毒具有了對(duì)抗自噬的能力。在此,我們分析了 IBDV病毒蛋白VP4與自噬的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)VP4可分布于自噬泡周圍,但與自噬泡標(biāo)志物L(fēng)C3不存在互作。過(guò)表達(dá)VP4能夠促進(jìn)LC3由I型向II型轉(zhuǎn)換,并導(dǎo)致P62累積,說(shuō)明自噬被VP4所抑制。進(jìn)一步我們證明VP4可以與自噬相關(guān)蛋白Beclin-1共定位并互作,提示VP4可能通過(guò)Beclin-1阻斷了自噬泡與溶酶體的融合或自噬泡在溶酶體中的降解。此外,我們還發(fā)現(xiàn)缺失C-末端兩個(gè)氨基酸的VP4具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力,這與其蛋白酶活性密切相關(guān)。
[Abstract]:浼犳煋鎬ф硶姘忓泭鐥呮槸涓，

本文編號(hào)：1405023