本文關(guān)鍵詞：鯉魚TLRs功能及鯉春病毒血癥病毒感染后免疫相關(guān)基因應(yīng)激表達機制的研究　出處：《上海海洋大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是識別病毒病原相關(guān)分子模式(Pattern associated molecular patterns,PAMPs)的主要模式識別受體(Pattern recognition receptors,PRRs),其識別病毒PAMPs后,通過依賴My D88(Myeloid differentiation factor 88,My D88)或TRIF(TIR domain-containing adaptor-inducing interferon-β,TRIF)信號傳導(dǎo)通路,誘導(dǎo)核因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)和干擾素調(diào)節(jié)因子(Interferon regulatory factors,IRFs)的表達,啟動固有免疫和適應(yīng)性免疫而抵御病毒入侵。至今在硬骨魚類中已鑒定了20種TLRs,大多數(shù)魚類TLRs能在哺乳動物中找到直系同源物;但有研究表明,魚類與哺乳類的TLRs功能發(fā)生了分化。鯉春病毒血癥病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)是一種彈狀病毒,可引起鯉科魚類及鯰科魚類大規(guī)模暴發(fā)鯉春病毒血癥(Spring viremia of carp,SVC)。SVC傳染快、死亡率高,可造成巨大的經(jīng)濟損失,已成為鯉科魚類養(yǎng)殖的最大威脅。鯉科魚類是我國淡水養(yǎng)殖的主要品種,產(chǎn)量占淡水養(yǎng)殖的20%以上;其中鯉魚正是SVCV主要的、最易感的宿主,但目前關(guān)于鯉魚抗病毒(SVCV)固有免疫應(yīng)答的知識非常有限。因此,本論文以鯉魚為研究對象,對與病毒先天性識別有關(guān)的TLRs及其下游信號通路中的干擾素相關(guān)免疫因子展開研究;并在建立鯉魚-SVCV感染模型的基礎(chǔ)上,從分子角度研究SVCV引起的宿主TLRs、非特異性免疫相關(guān)基因和炎癥相關(guān)基因表達量的變化,了解鯉魚抗SVCV免疫應(yīng)答的分子機制,為SVC的免疫防治提供理論指導(dǎo)。第一部分鯉魚抗病毒相關(guān)TLRs功能的研究首先應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴增獲得鯉魚TLR2、TLR3、TLR7、TLR9和TLR22基因(Cc TLRs),并將它們克隆入真核表達載體p EGFP-N1構(gòu)建過表達質(zhì)粒;然后將過表達質(zhì)粒p EGFP-N1-Cc TLRs和空載體質(zhì)粒p EGFP-N1同時轉(zhuǎn)染鯉魚上皮瘤(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC)細胞,采用實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染p EGFP-N1-Cc TLR2、p EGFP-N1-Cc TLR9和p EGFP-N1后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h細胞內(nèi)IRF3和IRF7以及干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)ISG15、Mx1、PKR和Viperin(Vig1)的m RNA轉(zhuǎn)錄水平,以及轉(zhuǎn)染p EGFP-N1-Cc TLR3和p EGFP-N1-Cc TLR7后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h細胞內(nèi)IRF3和IRF7的m RNA轉(zhuǎn)錄水平;并通過SVCV感染實驗探索了TLR2在EPC細胞中過表達激發(fā)的抗病毒效應(yīng)。結(jié)果顯示:在EPC細胞中轉(zhuǎn)染p EGFP-N1-Cc TLR2后IRF3、IRF7、ISG15、Mx1、PKR和Viperin的m RNA轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)明顯上調(diào),在轉(zhuǎn)染后48 h,其轉(zhuǎn)錄水平分別相當于轉(zhuǎn)染前的6.3倍、16.5倍、15.0倍、13.0倍、7.6倍和92.4倍,差異極顯著(P0.01);與轉(zhuǎn)染p EGFP-N1相比,轉(zhuǎn)染p EGFP-N1-Cc TLR2的EPC細胞IRF3、IRF7、ISG15、Mx1、PKR和Viperin的m RNA轉(zhuǎn)錄水平在轉(zhuǎn)染后48 h和72 h分別上調(diào)2倍和2.2倍、1.5倍和2.4倍、3.9倍和4.7倍、3.4倍和6.7倍、5.4倍和3.7倍、6.6倍和15.6倍,差異極顯著(P0.01);轉(zhuǎn)染p EGFP-N1組在感染SVCV后6 h、12 h、24 h、48 h和72 h的病毒量分別是轉(zhuǎn)染p EGFP-N1-Cc TLR2組的1.1倍、2.4倍、3.8倍、11.7倍和11.4倍,差異極顯著(P0.01)。因此,鯉魚TLR2在EPC細胞中過表達可上調(diào)IRF3、IRF7、ISG15、Mx1、PKR和Viperin基因的m RNA轉(zhuǎn)錄水平,以及抑制SVCV的增殖;提示魚類TLR2可通過激活I(lǐng)RF3或/和IRF7信號通路誘導(dǎo)I-IFN的產(chǎn)生,進而誘導(dǎo)ISG15、Mx1、PKR和Viperin等干擾素刺激基因表達抗病毒蛋白發(fā)揮抗病毒免疫效應(yīng)。在EPC細胞中轉(zhuǎn)染p EGFP-N1-Cc TLR9后IRF3、IRF7、ISG15、Mx1、PKR和Viperin的m RNA轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)明顯上調(diào),在轉(zhuǎn)染后72 h,其轉(zhuǎn)錄水平分別相當于轉(zhuǎn)染前的6.9倍、39.5倍、65.7倍、5.0倍、5.6倍和156.2倍,差異極顯著(P0.01);與轉(zhuǎn)染p EGFP-N1相比,轉(zhuǎn)染p EGFP-N1-Cc TLR9的EPC細胞IRF3、IRF7、ISG15、Mx1、PKR和Viperin的m RNA轉(zhuǎn)錄水平在轉(zhuǎn)染后48 h和72 h分別上調(diào)1.3倍和2.5倍、2.8倍和3.1倍、5.9倍和10.3倍、3.0倍和1.9倍、2.3倍和2.6倍、6.5倍和11.9倍,差異極顯著(P0.01)。研究表明,鯉魚TLR9在EPC細胞中過表達可上調(diào)IRF3、IRF7、ISG15、Mx1、PKR和Viperin基因的m RNA轉(zhuǎn)錄水平,其中Viperin、ISG15和IRF7上調(diào)較明顯,PKR上調(diào)幅度最小;提示魚類TLR9具有哺乳動物TLR9相似的功能,能通過激活I(lǐng)RF7信號通路誘導(dǎo)I-IFN的產(chǎn)生,進而誘導(dǎo)ISG15、Mx1和Viperin等干擾素刺激基因表達抗病毒蛋白發(fā)揮抗病毒免疫效應(yīng)。在EPC細胞中分別轉(zhuǎn)染p EGFP-N1-Cc TLR3和p EGFP-N1-Cc TLR7,IRF3和IRF7的m RNA轉(zhuǎn)錄水平與轉(zhuǎn)染前相比雖有上調(diào),但與轉(zhuǎn)染p EGFP-N1相比,差異不顯著(P?0.05),說明鯉魚TLR3/TLR7在EPC細胞中過表達對IRF3和IRF7基因的m RNA轉(zhuǎn)錄沒有明顯影響。此外,在本研究中沒有克隆到鯉魚TLR22。第二部分鯉魚免疫相關(guān)基因?qū)VCV感染的應(yīng)激表達機制研究通過對鯉魚注射低于致死劑量的SVCV(實現(xiàn)了較低的死亡率),研究每條魚Toll樣受體通路中從模式識別受體到抗病毒基因的各免疫相關(guān)基因應(yīng)激表達情況。這包括(1)Toll樣受體:TLR2、TLR3和TLR7;(2)干擾素調(diào)節(jié)因子:IRF3和IRF7;(3)干擾素基因:IFNa1、IFNa2和IFNa1S;(4)干擾素刺激基因:ISG15、Mx1、Vig1、PKR和ADAR;(5)促炎性細胞因子:IL1β、IL6和IL10。結(jié)果顯示:SVCV在3 hpi就開始在宿主細胞中復(fù)制,6 hpi病毒數(shù)量開始激增,至3 dpi達到最大值;在5 dpi,病毒復(fù)制開始減少,但10 dpi病毒載量依然處在一個較高水平。感染后同一時間點不同樣本體內(nèi)病毒量變化很大,且發(fā)現(xiàn)多數(shù)樣本組有一個病毒復(fù)制水平高的樣本(33%),這個比例與死亡率相近,由此推測攜帶病毒多的魚在感染后期會死亡。鯉魚頭腎中TLRs及其信號通路中免疫相關(guān)基因表達量的變化如下:(1)TLR2、TLR3和TLR7的轉(zhuǎn)錄水平在3 hpi就開始出現(xiàn)上調(diào),且分別在3 dpi、12 hpi和1 dpi達到高峰;隨后開始下降,至10 dpi,3個TLRs的轉(zhuǎn)錄仍處在一個低水平的上調(diào)。(2)IRF3和IRF7的轉(zhuǎn)錄水平在3 hpi就開始出現(xiàn)上調(diào),且分別在1 dpi和3 dpi達到高峰;隨后,IRF3和IRF7的轉(zhuǎn)錄水平開始逐漸下降,但一直處于上調(diào)狀態(tài);且IRF7的上調(diào)幅度比IRF3明顯,至10 dpi,仍處于較高的轉(zhuǎn)錄水平。(3)IFNa1和IFNa2的轉(zhuǎn)錄水平在12 hpi出現(xiàn)明顯上調(diào),并在3 dpi達到高峰,但IFNa1S的轉(zhuǎn)錄水平一直很低;在5 dpi和7 dpi時,IFNa1和IFNa1S的轉(zhuǎn)錄水平與對照組相似,而IFNa2一直處在一個較高水平的上調(diào)。(4)ADAR、ISG15、Mx1、PKR和Vig1的轉(zhuǎn)錄水平在12 hpi開始出現(xiàn)明顯上調(diào);其中ADAR、ISG15和PKR在1 dpi上調(diào)達到高峰,3 dpi后開始逐漸下降,但在整個實驗期間仍保持上調(diào)狀態(tài);Mx1和Vig1在1 dpi和3 dpi高水平上調(diào)表達并達到高峰,在5 dpi減少,但表達水平仍相對較高。(5)IL1β、IL6和IL10的轉(zhuǎn)錄水平在3 hpi和6 hpi時出現(xiàn)下調(diào),但在12 hpi和1 dpi時上調(diào)至較高水平;隨后IL6和IL10出現(xiàn)下調(diào),而IL1β則一直保持上調(diào)狀態(tài)。從上述研究結(jié)果看,各免疫相關(guān)基因可受病毒刺激而上調(diào)表達,表達量基本與體內(nèi)病毒量成正比。綜上,鯉魚感染SVCV后,病毒在很短的時間內(nèi)開始在宿主細胞中復(fù)制,并以指數(shù)速率增加;病毒感染早期,TLR2、TLR3和TLR7迅速上升到一個比較高的水平,啟動免疫刺激信號,刺激IRFs、I-IFNs和ILs的表達;在病毒感染的中后期,ADAR、ISG15、Mx1、PKR和Vig1等干擾素刺激基因大量表達發(fā)揮抗病毒免疫效應(yīng)。因此,SVCV(彈狀病毒)可以刺激機體上調(diào)先天性免疫因子的表達以抵抗病毒,且主要以I-IFNs介導(dǎo)的抗病毒免疫應(yīng)答為主,即TLR2、TLR3和TLR7識別病毒后可能能夠通過IRFs/I-IFNs/ISGs信號途徑激活抗病毒反應(yīng)。
[Abstract]:Toll like receptors (Toll-like receptors TLRs) is a viral pathogen associated molecular pattern recognition (Pattern associated molecular patterns, PAMPs) are pattern recognition receptors (Pattern recognition, receptors, PRRs), the identification of PAMPs virus, D88 (Myeloid differentiation My based on factor 88, My D88) or TRIF (TIR domain-containing adaptor-inducing interferon- beta, TRIF) signal transduction pathway induced by nuclear factor kappa B (factor- K Nuclear B NF- K B) and interferon regulatory factor (Interferon regulatory, factors, IRFs) expression, and initiate innate and adaptive immunity against invading viruses. So far in the teleost fish have been identified in 20 kinds of TLRs, TLRs can find the most fish orthologues in mammals; but research has shown that the differentiation of fish and mammalian TLRs. Spring viraemia of carp (Spring viremia of car P virus, SVCV) is a rhabdovirus, can cause cyprinid fish and grouper large-scale outbreaks of spring viremia (Spring viremia of carp, SVC).SVC infection quickly, the mortality rate is high, can cause huge economic losses, has become the biggest threat of cyprinid fish breeding. Carp is the main freshwater aquaculture species in China, freshwater aquaculture production accounts for more than 20%; the main carp is SVCV, the most susceptible hosts, but on the common carp (SVCV) antiviral innate immune response knowledge is very limited. Therefore, the carp as the research object, to study the virus and identification of congenital interferon immune factors related to TLRs and its downstream signaling pathway; and based on common carp -SVCV infection model, SVCV research from the perspective of molecular host TLRs genes expression of genes related to nonspecific immunity and inflammation Change, understand the molecular mechanism of carp anti SVCV immune response, to provide theoretical guidance for the prevention of immune SVC. The first part of the study of carp antiviral related TLRs function is first applied to RT-PCR was amplified from TLR2 TLR3, TLR7, carp, TLR9 and TLR22 genes (Cc TLRs), and they are cloned into the eukaryotic expression vector of P EGFP-N1 construction of expression plasmid; then overexpression plasmid P EGFP-N1-Cc TLRs and empty plasmid P EGFP-N1 and transfection of carp (Epithelioma papulosum cyprinid, epithelial tumor cells, EPC) detected by real-time fluorescent quantitative PCR EGFP-N1-Cc TLR2 P EGFP-N1-Cc was transfected into P, TLR9 and P EGFP-N1 after 0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h and H 72 cells IRF3 and IRF7 and interferon stimulated genes (IFN-stimulated genes, ISGs) ISG15, Mx1, PKR and Viperin (Vig1) m RNA and P EGFP-N1-Cc transcription, transfection of TLR3 and P EGFP-N1-Cc TLR7 0 h, 6 h, 12 h, 24 h,48 h鍜，

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