本文關(guān)鍵詞：稻瘟病菌兩個(gè)致病相關(guān)基因ZNF1和CKS1的鑒定及生物學(xué)功能分析　出處：《浙江大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病(rice blast)是水稻上的重要病害,每年可造成10-30%的稻谷產(chǎn)量損失,嚴(yán)重威脅世界水稻種植和糧食安全。由于經(jīng)濟(jì)的重要性和分子遺傳的可操作性,稻瘟病菌-水稻互作機(jī)制已成為研究病原菌-寄主植物互作的模式系統(tǒng)。對(duì)稻瘟病菌致病分子機(jī)理的深入了解不僅有利于病害防治策略的研發(fā),而且對(duì)其它植物病原真菌致病機(jī)理的認(rèn)識(shí)具有指導(dǎo)意義。本文通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化和生物信息學(xué)分析鑒定了2個(gè)稻瘟病菌致病相關(guān)基因：ZNFl和CKS1。通過(guò)基因敲除、表型分析、熒光標(biāo)記、酵母雙雜交等分子生物學(xué)技術(shù)分析了ZNF1和CKS1在稻瘟病菌形態(tài)發(fā)育和致病過(guò)程中的作用,主要研究結(jié)果如下：1.建立了T-DNA插入突變體庫(kù),獲得了XF696等5個(gè)致病缺陷突變體為獲得與稻瘟病菌致病相關(guān)新基因,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三次ATMT轉(zhuǎn)化,共獲得2200個(gè)T-DNA插入突變體。其中5個(gè)突變體(XF577, XF696, XF1379, XF1521,XF1557)對(duì)寄主的致病性完全喪失。Tail-PCR以及生物信息學(xué)分析明確了5個(gè)突變體的T-DNA標(biāo)記基因分別為BUF1 (MGG_02252), MGG_14931, STU1 (MGG_00692), MKK2 (MGG_06482), MST12 (MGG_12958)。其中 XF696 的T-DNA標(biāo)記基因MGG_14931的生物學(xué)功能尚未報(bào)道。2.ZNF1在稻瘟病菌附著胞發(fā)育、成熟以及侵染過(guò)程中有重要作用XF696突變體中T-DNA標(biāo)記基因MGG_14931編碼一個(gè)假定的C2H2鋅指蛋白,將該基因命名為ZNF1 (Maganporthe oryzae zinc finger protein)。 ZNF1 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有兩種不同的剪切形式：SⅠ和SⅡ,SⅠ為主要剪切方式,并具有正常功能,而SⅡ沒(méi)有功能。基因敲除、互補(bǔ)、表型分析及qRT-PCR等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：1)敲除ZNF1不影響稻瘟病菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、色素沉積以及有性生殖；2)△znf1產(chǎn)孢能力顯著增加,說(shuō)明ZNF1可能負(fù)調(diào)控分生孢子的形成；3)△znf1突變體對(duì)大麥和水稻的致病性完全喪失,即使在劃傷或針刺的大麥和水稻葉片表面都不能產(chǎn)生病斑；4)△znf1突變體芽管頂端可以分化形成膨大結(jié)構(gòu),但是不能形成正常的附著胞,也不能穿透寄主表皮；5)外源cAMP或IBMX能夠誘導(dǎo)△znf1突變體分生孢子在親水或疏水表面上產(chǎn)生囊泡狀的膨大結(jié)構(gòu)。但外源添加cAMP或IBMX不能完全恢復(fù)△znf1附著胞形成缺陷；6)qRT-PCR以及GFP熒光檢測(cè)表明,稻瘟病菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和產(chǎn)孢階段ZNFl表達(dá)水平較低,而附著胞發(fā)育與成熟階段ZNFl表達(dá)水平顯著升高。在突變體△pmkl中,ZNF1表達(dá)水平受到抑制。表明ZNF1在附著胞發(fā)育階段表達(dá)水平受Pmk1 MAPK信號(hào)途徑調(diào)控；7)NileRed和I2/KI染色表明,ZNF1參與附著胞形成過(guò)程中脂滴和糖原的移動(dòng)以及降解；8)H1-RFP標(biāo)記顯示△znf1附著胞形成過(guò)程中,芽管尖端能進(jìn)行多次有絲分裂,但細(xì)胞核不被降解,細(xì)胞自噬性降解過(guò)程受阻；9)結(jié)構(gòu)域缺失和點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)顯示3個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)以及核定位信號(hào)序列(NLS)對(duì)Znfl蛋白功能起重要作用。3. CES1編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物的亞基(Cyclin-dependent kinase subunit),參與稻瘟病菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、致病性等重要過(guò)程在先前的研究中,本實(shí)驗(yàn)室鑒定了一個(gè)新的稻瘟病菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Soml。研究表明Soml作用于稻瘟病菌cAMP-PKA信號(hào)途徑下游,在稻瘟病菌形態(tài)分化和致病性中起關(guān)鍵作用。本研究根據(jù)△soml的SAGE (serial analysis of gene expression)表達(dá)譜測(cè)序數(shù)據(jù)并結(jié)合生物信息學(xué)分析,選取了8個(gè)可能與Soml相關(guān)的基因進(jìn)行了敲除,其中△cksl表型明顯與野生型菌株不同。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)CKS1的生物學(xué)功能進(jìn)行了分析,結(jié)果如下：1)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證明稻瘟病菌中Cksl與Soml之間存在互作；2)△cksl突變體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢,菌落發(fā)白,氣生菌絲蓬松,不能產(chǎn)生分生孢子；3)qRT-PCR分析顯示,色素合成基因ALB1、RSYl和BUFl,以及產(chǎn)孢相關(guān)基因COS1、CON7、ACRl1、HTF1(HOX2)在△cks1中顯著下調(diào)；4)△cksl能在菌絲尖端產(chǎn)生附著胞結(jié)構(gòu),但附著胞功能喪失,不能穿透寄主表皮,也不能在寄主組織內(nèi)進(jìn)行侵染生長(zhǎng)；5)△cks1突變體幾乎完全喪失對(duì)大麥和水稻的致病性；6)△cksl菌落疏水性下降,菌落呈現(xiàn)自溶現(xiàn)象；7)△cks1突變體對(duì)細(xì)胞壁壓力脅迫抗性增加,幾丁質(zhì)合成酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平在△cks1中明顯上調(diào),表明CKS1參與維持稻瘟病菌細(xì)胞壁完整性；8)小麥赤霉病菌的FgCKS1能恢復(fù)稻瘟病菌△cks1的表型缺陷,表明在絲狀病原真菌中Cks1結(jié)構(gòu)和功能都非常保守；9)Cksl-GFP融合蛋白亞細(xì)胞定位分析表明,Cks1在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段主要定位于細(xì)胞質(zhì)中,而分生孢子形成階段,細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有明顯的分布；10)結(jié)構(gòu)域缺失實(shí)驗(yàn)表明Cks1蛋白中Ubiquitin-binding domain, Cdc28-binding domain 以及 Anion-binding site對(duì)Cks1蛋白發(fā)揮正常功能有重要作用；11)酵母雙雜交表明,稻瘟病菌中Cks1與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶Cdc28存在互作,Cdc28-GFP融合蛋白定位顯示Cdc28與Cks1有相似的胞內(nèi)定位模式。
[Abstract]:Rice blast is an important disease in rice , which can cause 10 - 30 % of rice yield loss per year . The results are as follows : 1 . The research results are as follows : 1 . The research results are as follows : 1 . The research results are as follows : 1 . The research results are as follows : 1 . We have identified two genes of rice blast disease - related genes : ZNFl and CKS1 . The expression level of ZNFl was significantly increased , but the expression level of ZNFl was significantly increased . The results were as follows : 1 ) The results showed that : 1 ) The expression of 鈻，

本文編號(hào)：1392261