本文關(guān)鍵詞：大白菜復(fù)等位基因遺傳雄性不育分子機(jī)理研究　出處：《沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：大白菜是完全花異花授粉作物,具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)。在配制雜交種的過(guò)程中,雄性不育材料的利用是一種較好的雜交制種途徑。大白菜雄性不育遺傳機(jī)理和分子機(jī)制研究一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。在前期研究中,本課題組發(fā)現(xiàn)了一份大白菜復(fù)等位基因遺傳的雄性不育材料,并用其配制出了具有100%不育株率的核基因雄性不育系。利用該不育材料構(gòu)建分離群體,對(duì)不育基因進(jìn)行了定位,將其定位在A07染色體6700-6800kb之間。為了克隆不育基因,本研究利用該不育系統(tǒng)的純合不育株(MsMs)構(gòu)建BAC文庫(kù),通過(guò)篩選定位區(qū)間內(nèi)的BAC克隆,進(jìn)行測(cè)序比對(duì),尋找差異基因；通過(guò)對(duì)雄性不育“兩用系”可育株(MsfMs)與不育株(MsMs)花蕾進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,找出差異表達(dá)基因并分析它們的功能和參與的代謝途徑；鑒定花蕾中表達(dá)的miRNAs,并對(duì)其進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè),探尋miRNA在雄蕊育性調(diào)控中的作用。上述研究結(jié)果可以為篩選鑒定大白菜核不育復(fù)等位基因(Ms、Msf和ms)奠定基礎(chǔ),并為核雄性不育相關(guān)基因和miRNAs的研究提供了數(shù)據(jù)庫(kù),有助于揭示大白菜雄性不育的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：1.通過(guò)對(duì)大白菜雄性不育“兩用系”的不育株與可育株花蕾形態(tài)觀察,發(fā)現(xiàn)不育株除雄蕊不產(chǎn)生花粉外,其他花器官發(fā)育正常。利用石蠟切片對(duì)不育株與可育株花藥細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)花藥發(fā)育前期兩者沒(méi)有明顯差異,后期不育株花粉母細(xì)胞不能進(jìn)行正常的減數(shù)分裂,絨氈層細(xì)胞異常膨脹,導(dǎo)致不育株花藥的花粉囊皺縮。2.根據(jù)前期對(duì)大白菜雄性不育基因Ms及其恢復(fù)基因Msf的定位結(jié)果,設(shè)計(jì)篩庫(kù)引物,在利用雄性不育“兩用系”不育株葉片構(gòu)建的BAC文庫(kù)中篩選到2個(gè)對(duì)應(yīng)定位區(qū)間內(nèi)的BAC克隆,即FH20-SRF1和FH48-LCSK5。利用第3代測(cè)序技術(shù),對(duì)這2個(gè)BAC克隆進(jìn)行測(cè)序,FH20-SKRF1插入基因的長(zhǎng)度為127658bp, FH48-LCSK5為130005bp。兩個(gè)BAC克隆可以拼接,拼接后長(zhǎng)度為233305bp,重疊區(qū)域有24358bp。在拼接后的序列中能找到篩庫(kù)引物SKRF1和LCSK5,并且定位標(biāo)記LZY6位于拼接序列68462-68849bp的區(qū)域,說(shuō)明這2個(gè)BAC克隆能夠完全覆蓋A07染色體6700-6800kb區(qū)間。將拼接序列與Brassica Database中的大白菜基因組序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)部分區(qū)域發(fā)生了倒位,并有大片段插入。對(duì)拼接序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè),共預(yù)測(cè)到57個(gè)基因。在MsfMsf基因型材料中將這57個(gè)基因進(jìn)行克隆測(cè)序,發(fā)現(xiàn)有7個(gè)基因的序列與MsMs基因型材料的BAC克隆存在差異,且這7個(gè)基因全部位于插入片段區(qū)域。3.利用RNA-seq技術(shù),對(duì)大白菜雄性不育“兩用系”可育株與不育株的花蕾進(jìn)行測(cè)序分析,按照無(wú)參考基因組進(jìn)行unigene組裝,分別得到了70703和70799個(gè)unigene。將BAC克隆測(cè)序比對(duì)得到的7個(gè)存在序列差異的基因,與unigene進(jìn)行比對(duì),有5個(gè)能夠比對(duì)上,說(shuō)明這5個(gè)基因真實(shí)存在并且能夠正常表達(dá)。4.對(duì)大白菜雄性不育“兩用系”可育株與不育株花蕾中的基因表達(dá)水平進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)有1013個(gè)差異表達(dá)基因,包括與花粉發(fā)育相關(guān)的AMS、MS2、VGD1以及果膠酶類(lèi)基因等等。在這些差異表達(dá)基因中,有475個(gè)在可育花蕾中特異性表達(dá),6個(gè)在不育花蕾中特異性表達(dá)。這些特異性表達(dá)基因中有82個(gè)基因編碼未知功能蛋白,其中大部分在花粉和花粉萌發(fā)階段表達(dá)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析,顯著富集的GO terms有19個(gè)。對(duì)所有的差異表達(dá)基因進(jìn)行pathway富集分析,共富集到5條pathway,分別是：①戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換途徑、②丙氨酸、天門(mén)冬氨酸和谷氨酸代謝途徑、③半胱氨酸和蛋氨酸代謝途徑、④維生素C代謝途徑、⑤淀粉蔗糖代謝途徑。利用qRT-PCR對(duì)其中的30個(gè)差異表達(dá)基因在“兩用系”可育株與不育株花蕾中的表達(dá)量進(jìn)行分析,其結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致,驗(yàn)證了測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。5.以大白菜雄性不育“兩用系”可育株與不育株花蕾為試材,分別構(gòu)建small RNA測(cè)序文庫(kù),進(jìn)行高通量測(cè)序,在兩文庫(kù)中分別獲得了132和144個(gè)已知的miRNA,并預(yù)測(cè)到22和24個(gè)新的miRNA。對(duì)35個(gè)已知的miRNA家族進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè),并對(duì)靶基因進(jìn)行了功能注釋。篩選出19個(gè)miRNA在不育株與可育株花蕾中差異表達(dá)。在這19個(gè)差異表達(dá)的miRNA中,大部分在不育花蕾中表達(dá)量高,只有5個(gè)在可育花蕾中表達(dá)量高。這些差異表達(dá)的miRNA的靶基因,部分與花、雄蕊、花粉的發(fā)育相關(guān),例如AP2、果膠甲酯酶抑制劑家族蛋白等。有5個(gè)miRNA的靶基因在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中也為差異表達(dá)基因,說(shuō)明其可能受miRNA調(diào)控。對(duì)所有差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,其結(jié)果與測(cè)序結(jié)果大體相同,驗(yàn)證了測(cè)序結(jié)果的可靠性。
[Abstract]:In order to clone the sterile gene , the genetic mechanism and molecular mechanism of male sterile plants were identified . In this study , we found that there were a number of differentially expressed genes , including AMS , MS 2 , VGD1 and pectinase genes .

【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S634.1

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本文編號(hào)：1390015