本文關鍵詞：半滑舌鰨游離神經(jīng)丘形態(tài)特征及其分子水平功能解析研究　出處：《上海海洋大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)隸屬于鰈形目((Pleuronectoidei),身體呈舌狀、左右不對稱,兩眼位于身體同一側,多匍匐于水底或身藏在泥沙內而眼外露,習慣夜間覓食。由于其個體大、生長速度快、出肉率高,肉質細嫩,味道鮮美,高蛋白低脂肪,經(jīng)濟效益高,已成為我國增養(yǎng)殖對象的首選。在其人工養(yǎng)殖過程中,因其特殊的生活習性,導致其攝食率低,生長緩慢等問題,嚴重制約其推廣養(yǎng)殖。先前研究證實半滑舌鰨具有發(fā)達的皮膚感覺器官——側線系統(tǒng),行為學實驗結果表明在其攝食過程中,側線系統(tǒng)起主導作用,且頭部的側線系統(tǒng)在半滑舌鰨攝食過程中發(fā)揮重要的作用。同時,先期研究發(fā)現(xiàn)與以往文獻“半滑舌鰨無眼側被似圓鱗的弱櫛鱗”不同的是半滑舌鰨頭部無眼側無鱗,側線系統(tǒng)發(fā)達,存在大量游離神經(jīng)丘。半滑舌鰨游離神經(jīng)丘形態(tài)特征及功能有待于深入研究,為進一步探索其感覺功能與行為等提供理論依據(jù),同時也能為其他鰈形目魚類養(yǎng)殖開發(fā)提供借鑒與指導。1.半滑舌鰨游離神經(jīng)丘形態(tài)分布及發(fā)育特征在半滑舌鰨個體發(fā)育過程中,(1)游離神經(jīng)丘分布變化:10日齡仔魚游離神經(jīng)丘已出現(xiàn)在眼睛和嗅孔周圍,變態(tài)完成伏底生活后,40日齡稚魚游離神經(jīng)丘數(shù)量急劇增加且已布滿整個無眼側頭部,成魚期游離神經(jīng)的數(shù)量更密集,且在前嗅孔周圍密集程度最高;在40日齡時游離神經(jīng)丘的分布是呈線性的,游離神經(jīng)丘是單個存在的,到50日齡稚魚期其分布就變得無規(guī)則且雜亂,由于其周圍皮膚皺褶的存在,游離神經(jīng)丘變得成簇存在,半滑舌鰨成魚游離神經(jīng)丘成簇存在,無規(guī)則雜亂分布在無眼側頭部。(2)游離神經(jīng)丘形態(tài)變化:游離神經(jīng)丘頂部膠質頂由圓筒狀變?yōu)楸鈸鸂?其頂部形狀也從圓形變?yōu)樗慕切切?存在與頂部的感覺板也由圓形變?yōu)殚L條形。研究推測10日齡半滑舌鰨仔魚的游離神經(jīng)丘的存在能夠協(xié)助在其眼睛還沒有發(fā)育完全的狀態(tài)下定位和攝食食物;變態(tài)完成后無眼側頭部大量的游離神經(jīng)丘分布,有利于其感知周圍水流變化適應底棲生活。游離神經(jīng)丘雜亂密集的分布以及其形態(tài)的變化能夠加強其對周圍環(huán)境的敏感性,有利于其感知水流運動,協(xié)助攝食或避敵。綜上所述,推測半滑舌鰨游離神經(jīng)丘在其攝食感覺功能中發(fā)揮重要作用。2.半滑舌鰨trp通道超家族克隆及cstrpv4組織表達研究本文首次從半滑舌鰨中克隆獲得6個trp家族基因序列,經(jīng)鑒定與機械感覺相關的有4個:trpv4、trpv1、trpc1和trpm7;與化學感覺相關的有2個:trpm5和trpp3。通過race技術克隆得到trpv4基因全長,其cdna全長為3104bp,包括一個2613bp的開放閱讀框,編碼870個氨基酸,5’上游區(qū)有一段非編碼區(qū)(utr)區(qū)域大小為237bp,3’下游區(qū)有一段大小為254bp的utr區(qū),并且3’-utr包含poly-a尾巴,該cdna能夠完整編碼一個蛋白質,其蛋白分子量約為98.75kda等電點為8.07。氨基酸序列預測包括6個跨膜區(qū)(transmembrane,tm)(tm1-tm6)和位于t5與t6區(qū)之間的孔道環(huán)(poreloop,pl)結構,通道蛋白的氨基端存在4個錨連蛋白重復區(qū)(ankyrinrepeatdomains,ank)和核蛋白定位信號序列(nuclearlocatlizationsignalsequence,nls),羧基端存在trp結構域(trpdomains)和鈣調蛋白結合域(calmodulinbindingdomains,cambd)。同源序列分析表明與其他物種的trpv4存在高度的同源性,與與深裂鋸眶雀鯛、羅非魚、鱸魚、斑馬魚、熱帶爪蟾、大鼠、小鼠和人的trpv4序列分別有90.1%,84.8%,81.0%,77.1%,74.1%,72.4%、72.4%和72.9%的一致性。系統(tǒng)進化樹研究結果表明(包括半滑舌鰨),所有脊椎動物聚為一簇,線蟲聚為一簇;脊椎動物中,所有的硬骨魚聚為一簇,其他聚為一簇。所有的哺乳動物都聚在一簇,同屬內種間親緣關系表現(xiàn)為最近,例如大鼠和小鼠。這一結果正確的反應了所選物種間的進化關系。研究了cstrpv4在其各個組織mrna的表達模式。結果表明cstrpv4在各個組織廣泛表達,心臟中表達量最高,且與其他組織表達差異顯著;在脾臟和眼睛中表達次之;在精巢中表達顯著高于腎臟和肝臟;進一步研究了cstrpv4在其六個感覺器官表達模式,眼睛表達最高,游離神經(jīng)丘表達次之且顯著高于其他感覺器官。研究推測cstrpv4在眼睛中大量的表達可能與其感受外界水流壓力有關;cstrpv4在游離神經(jīng)丘中較高的表達,可能發(fā)揮其機械感覺功能,并在攝食中發(fā)揮作用。綜上,trp超家族在感覺生理中有極其重要的作用,半滑舌鰨中存在的trp家族種類及表達分布情況,能夠為其感受器感覺功能屬性的界定提供了新的思路和方法。3.半滑舌鰨cstrpv4在游離神經(jīng)丘定位及機械感覺功能研究trpv4是目前公認的具有機械感覺功能的蛋白通道。半滑舌鰨中游離神經(jīng)丘中cstrpv4的存在、基因定位及功能分析,可以為魚類游離神經(jīng)丘感覺屬性界定提供理論依據(jù),完善魚類側線系統(tǒng)的功能研究;同時也有助于半滑舌鰨養(yǎng)殖技術的改進與發(fā)展。本文首次從分子水平分析與探討游離神經(jīng)丘的功能。(1)原位雜交結果顯示cstrpv4的存在于1日齡半滑舌鰨仔魚和5月齡半滑舌鰨的游離神經(jīng)丘中,在游離神經(jīng)丘的套細胞、感覺細胞和特有柄狀結構都有表達。(2)通過rna干擾技術干擾降低游離神經(jīng)丘中cstrpv4的表達,觀測其對攝食行為的影響。結果顯示干擾組相較于側線封閉組,對頭部前方低頻的振動源攻擊率顯著降低,相較于游離神經(jīng)丘封閉組卻顯著提高;表明cstrpv4基因表達量的降低,在一定程度上影響游離神經(jīng)丘對頭部前方低頻振動小球的感覺定位,在游離神經(jīng)丘中發(fā)揮著機械感覺功能,同時行為學研究發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨頭部無眼側游離神經(jīng)丘在其攝食過程中,尤其在攝食頭部前方低頻食物時發(fā)揮主要作用,顯著高于側線對其作用。4.半滑舌鰨與其他五種鰈形目魚類無眼側皮膚形態(tài)比較及攝食相關性功能探采用掃描電鏡技術首次對半滑舌鰨及其他五種鰈形目魚類的無眼側頭部皮膚可能存在的感覺器官進行觀察比較研究,以期獲得與攝食行為等生態(tài)習性相關的新發(fā)現(xiàn),為其在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中,選擇和制作合適的餌料和選擇合理的投喂方式提供理論依據(jù),以期獲得與攝食行為等生態(tài)習性相關的新發(fā)現(xiàn)。結果顯示,半滑舌鰨和塞內加爾鰨(soleasenegalensis)的無眼側頭部皮膚存在大量游離神經(jīng)丘,但其形態(tài)特征存在差異。半滑舌鰨皮膚表面的游離神經(jīng)丘類似于乳頭狀突起,突起上有表皮細胞形成的微脊,多個為一簇,很少單獨存在,呈無規(guī)則排列;而塞內加爾鰨的游離神經(jīng)丘直接裸露在皮膚表面,呈線性排列在肉芽狀皮膚突起的下方。星突江鰈(platichthysstellatus)的頭部無眼側皮膚表面零散分布著多個為一簇的游離神經(jīng)丘,形狀類似于半滑舌鰨的乳頭狀游離神經(jīng)丘。大菱鲆(scophthalmusmaximus)、黃蓋鰈(Pseudopleuronectes yokohamae)和條斑星鰈(Verasper moseri)的頭部無眼側皮膚表面沒發(fā)現(xiàn)游離神經(jīng)丘等特殊結構,但其表面都凹凸不平。研究推測鰈形目魚類頭部無眼側皮膚形態(tài)特征影響其攝食行為,其游離神經(jīng)丘的密集程度與其攝食習性密切相關;其頭部無眼側游離神經(jīng)丘的分布特征與種群分類存在一定的相關性,可為物種的分類提供一定的依據(jù)。綜上所述,本研究首次闡述了半滑舌鰨游離神經(jīng)丘形態(tài)分布及發(fā)育特征,分析比較了半滑舌鰨與其他5種鲆鰈魚類無眼側皮膚形態(tài),證實頭部無眼側游離神經(jīng)丘與其攝食習性密切相關。首次在游離神經(jīng)丘上定位到Cstrpv4的存在,并通過RNA干擾與行為學實驗證實CsTrpv4在游離神經(jīng)丘中發(fā)揮機械感覺功能,本研究為闡述魚類游離神經(jīng)丘功能提供了可靠且有力的理論依據(jù),同時也為魚類攝食感覺相關的研究提供基礎材料和參考。
[Abstract]:Semilaevis semilaevis ( Cynoglossus semilaevis ) belongs to Pleuronglossus idei , the body is tongue - shaped , left and right asymmetrical , and the two eyes are located on the same side of the body . In conclusion , it is suggested that the free nerve hillock of Cynoglossus semilaevis has a length of 237bp and its protein molecular weight is about 98.75 kda . The results showed that the expression of cstrpv4 in the free nerve hillock was significantly higher than that in the kidney and the liver . The results showed that the expression of cstrpv4 in the free nerve hillock was the highest , and the expression of cstrpv4 was higher than that of other sensory organs . ( 1 ) In situ hybridization showed that cstrpv4 was present in the free nerve hillock of Cynoglossus semilaevis and Cynoglossus semilaevis in 1 day .

【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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本文編號：1386306