本文關(guān)鍵詞：雙單倍體牙鲆純合不育個(gè)體的蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究　出處：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：牙鲆(Paralichthys olivaceus)個(gè)體大、生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美,被視為名貴的海產(chǎn)養(yǎng)殖魚類,深受我國(guó)廣大消費(fèi)者的喜愛(ài),市場(chǎng)銷售前景廣闊。牙鲆雌性生長(zhǎng)速度快于雄性,養(yǎng)殖全雌牙鲆對(duì)提高其生長(zhǎng)速度、縮短養(yǎng)殖周期和提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。利用有絲分裂雌核發(fā)育技術(shù)不僅能夠生產(chǎn)全雌魚,還能夠生產(chǎn)基因完全純合的個(gè)體,即雙單倍體(DH),在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行一代雌核發(fā)育可以生產(chǎn)基因型完全一致的純合克隆系,這對(duì)雌核發(fā)育育種的理論研究和實(shí)際應(yīng)用均具有重要意義。但存在的問(wèn)題是DH魚誘導(dǎo)困難,繁殖力低,極大的影響了DH和克隆魚的進(jìn)一步應(yīng)用。目前關(guān)于DH魚的繁殖問(wèn)題開展的研究工作較少,僅有的少量研究主要集中在繁殖能力的表型描述上,具體的不育機(jī)制尚不清楚。因此,本研究通過(guò)減數(shù)分裂雌核發(fā)育提高牙鲆純合度后,以此為親本誘導(dǎo)DH,探討提高DH誘導(dǎo)效率的可行性;同時(shí)以同齡性腺正常發(fā)育的牙鲆為對(duì)照,對(duì)DH牙鲆的促性腺激素和性類固醇激素含量進(jìn)行了測(cè)定,以期從內(nèi)分泌學(xué)角度揭示DH牙鲆性腺發(fā)育異常的原因;在此基礎(chǔ)上對(duì)同一家系可育和不育牙鲆的性腺進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的比較,篩選了可育和不育性腺的差異表達(dá)蛋白和基因,探討引起DH純合不育的分子機(jī)制,并為尋找其中起關(guān)鍵作用的蛋白和基因并研究其功能提供有用的信息。主要研究結(jié)果如下:(1)利用普通牙鲆親魚6尾(記為C1、C2、C3、C4、C5、C6)和減數(shù)分裂雌核發(fā)育組牙鲆6尾(記為G1、G2、G3、G4、G5、G6)進(jìn)行DH誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),探討親魚純合度與DH誘導(dǎo)率的關(guān)系。結(jié)果表明,雌核發(fā)育組的純合度極顯著高于普通組(P0.01),雌核發(fā)育組平均純合度為0.70,而普通組親魚的平均純合度僅為0.43。有5尾普通親魚(G2-G6)誘導(dǎo)的后代在開口前全部死亡,對(duì)剩余7尾親魚的后代在生長(zhǎng)至20日齡時(shí)各取30尾仔魚進(jìn)行后代純合性檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)有2尾雌核發(fā)育親魚的后代中出現(xiàn)了雜合個(gè)體,而在普通親魚后代中并未出現(xiàn),推測(cè)后代中是否出現(xiàn)雜合子與親本的純合度并無(wú)直接無(wú)關(guān)。從誘導(dǎo)率上來(lái)看,無(wú)論是折算孵化率還是折算正常率,雌核發(fā)育組均要顯著高于普通牙鲆組。通過(guò)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),親本純合度與折算孵化率的Pearson相關(guān)性密切,其相關(guān)系數(shù)為0.920,達(dá)到極顯著水平(P0.01);親本純合度與折算正常率的Pearson相關(guān)性密切,其相關(guān)系數(shù)為0.925,達(dá)到極顯著水平(P0.01)。另外,本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)了C1和G3的減數(shù)分裂雌核發(fā)育,其誘導(dǎo)率和正常率均高于有絲分裂雌核發(fā)育。(2)以2009年在北戴河中心實(shí)驗(yàn)站培育的DH牙鲆為材料,以同齡的兩性受精牙鲆為對(duì)照,在1月、3月和5月進(jìn)行尾部采血,采用酶聯(lián)免疫方法測(cè)定和比較了血清雌二醇(E2)、睪酮(T)、促黃體生成素(LH)、促卵泡生成素(FSH)和17α,20β-雙羥孕酮(17α,20β-DHP)的含量,同時(shí)在5月份取性腺進(jìn)行切片觀察發(fā)育情況,以期從內(nèi)分泌學(xué)角度揭示DH牙鲆性腺發(fā)育異常的原因。結(jié)果表明,DH組牙鲆性腺體積小,性腺成熟系數(shù)低,僅為4.0%,卵母細(xì)胞多為不規(guī)則的多角形,以II期和III期為主,外部只有一層濾泡細(xì)胞。而對(duì)照組牙鲆性腺體積大,性腺成熟系數(shù)極顯著高于DH牙鲆,達(dá)到了10.1%,細(xì)胞核膜消失并開始向動(dòng)物極遷移,此時(shí)卵巢內(nèi)以成熟的IV期和V期卵母細(xì)胞為主。激素水平上來(lái)看,在1月和3月份時(shí),各激素含量與對(duì)照組牙鲆均未出現(xiàn)顯著性差異,而5月份各激素含量均出現(xiàn)了顯著性變化,其中dh不育牙鲆的e2含量顯著低于對(duì)照組,同時(shí)lh和fsh的含量也要顯著低于對(duì)照組,t和17α,20β-dhp含量dh組卻顯著高于對(duì)照組,推測(cè)不育個(gè)體的t轉(zhuǎn)化為e2和e2與17α,20β-dhp途徑轉(zhuǎn)換過(guò)程中出現(xiàn)了異常。(3)以選取同一dh家系中3條能夠正常產(chǎn)卵的dh牙鲆為對(duì)照,3條無(wú)法正常產(chǎn)卵的dh牙鲆為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)學(xué)研究。通過(guò)雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)可育和不育的蛋白質(zhì)組結(jié)果進(jìn)行比較,共發(fā)現(xiàn)了42個(gè)差異顯著的蛋白,其中不育組中高表達(dá)蛋白11個(gè),可育組中高表達(dá)蛋白31個(gè)。31個(gè)可育組高表達(dá)蛋白當(dāng)中有2個(gè)蛋白只在可育組中表達(dá),不育組中未見表達(dá)。差異蛋白中vtg在不育組中的含量要顯著低于可育組,這與組織切片中觀察到的不育組卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中卵黃積累不足相一致,暗示不育組性腺發(fā)育停止與vtg的含量較低有關(guān)。性類固醇調(diào)控相關(guān)的2個(gè)蛋白,核基質(zhì)結(jié)合因子2(safb2)和膽固醇側(cè)鏈內(nèi)切酶(p450scc)也在不育組中低量表達(dá),尤其是safb2在不育組中未見表達(dá),會(huì)對(duì)不育dh牙鲆的性類固醇生成途徑產(chǎn)生影響。此外,3個(gè)和鈣離子平衡相關(guān)的蛋白在不育組中的表達(dá)同樣低于可育組,分別為nucb1、efcab3和efcab4b蛋白,推測(cè)這3個(gè)蛋白通過(guò)調(diào)控鈣離子的平衡來(lái)影響牙鲆的性腺發(fā)育。(4)采用rna-seq技術(shù)研究了同一家系可育dh牙鲆和不育dh牙鲆性腺組織的轉(zhuǎn)錄組,并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用cap3軟件聚集全部轉(zhuǎn)錄樣本的裝配結(jié)果,獲得的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果包括了52474個(gè)contigs和n50長(zhǎng)度是2895bp;應(yīng)用bwa軟件將cleanreads定位到all-unigene,定位率可以達(dá)到99%,說(shuō)明裝配質(zhì)量良好;獲得的unigenes中有31831條能夠比對(duì)到斑馬魚上,通過(guò)go注釋可以發(fā)現(xiàn),有29416條unigenes注釋到了生物學(xué)進(jìn)程,29475條unigenes注釋到了分子功能,29464條unigenes注釋到了細(xì)胞組分。對(duì)可育組和不育組表達(dá)差異的unigene進(jìn)行篩選,得到差異表達(dá)unigenes1225個(gè),包括492個(gè)上調(diào)unigenes和733個(gè)下調(diào)unigenes。1225條unigenes當(dāng)中有573個(gè)基因被注釋,其中351個(gè)參與了生物學(xué)進(jìn)程,63個(gè)處于細(xì)胞位置和128個(gè)具有分子功能(p0.01)。顯著上調(diào)基因主要參與了甾醇代謝進(jìn)程、類固醇生物合成進(jìn)程和c21類固醇生物學(xué)合成等進(jìn)程,在這些進(jìn)程中主要是cyp11a1,cyp11b2,cyp17a1,cyp21a1,hsd3β和prlr這6個(gè)基因高量表達(dá)。顯著的下調(diào)基因主要參與了免疫反應(yīng)、維生素d代謝進(jìn)程、抗原加工、血紅蛋白輸入、腎吸收、轉(zhuǎn)胞吞作用、脂肪蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白質(zhì)水解作用等進(jìn)程。通過(guò)kegg數(shù)據(jù)對(duì)差異顯著基因進(jìn)行pathway分析,利用fishexactrest檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)62個(gè)pathways具有顯著性,包括26個(gè)顯著上調(diào)的pathways和36個(gè)顯著下調(diào)的pathways。最顯著的pathway是類固醇生物合成途徑,主要被4個(gè)基因影響,分別是cyp11a1,cyp11b2,cyp17a1和cyp21a1。另外一個(gè)重要的途徑是卵巢類固醇生成途徑,其它重要的途徑包括金黃色釀膿葡萄球菌感染、自身免疫甲狀腺疾病、造血細(xì)胞系、蛋白消化和吸收等主要受下調(diào)基因影響。綜合上述,本研究得到以下結(jié)論:親魚的純合度越高,dh的孵化率越高,孵化出的個(gè)體畸形率越低,利用減數(shù)分裂雌核發(fā)育提高后代的純合度,再進(jìn)行誘導(dǎo)dh,可以提高dh牙鲆的誘導(dǎo)效率。通過(guò)對(duì)可育牙鲆和不育牙鲆的蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析可以看出,一些調(diào)控性固醇激素合成進(jìn)程中的重要基因和蛋白,如cyp11a1、cyp11b2、cyp17a1、cyp21a1、safb2等均在不育牙鲆中低量表達(dá),而且通過(guò)激素水平測(cè)定也發(fā)現(xiàn),lh、fsh和e2在繁殖季節(jié)均要顯著低于可育組,這可能是引起dh牙鲆卵母細(xì)胞發(fā)育滯后,性腺不能正常發(fā)育的主要原因。
[Abstract]:Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) individual large, fast growth, meat is tender and delicious, is regarded as a rare fish mariculture, popular among consumers in China, the market prospect is broad. The female flounder grew faster than males, breeding of all female flounder to improve its growth rate, shorten the breeding cycle and has important significance in improving the economic benefits of farming. Using mitogynogenetic technology can not only produce all female, also can produce gene completely homozygous individuals, namely double haploid (DH), then the generation of gynogenesis can produce identical genotype homozygous clones, the gynogenesis breeding theoretical research and practical application has important significance. But the problem is that DH induced fish difficult, low fecundity, greatly affected the further application of DH and cloned fish. At present DH on fish reproduction Q The research work carried out less, only few studies focused on the reproductive capacity of the phenotypic description, sterile specific mechanism is not clear. Therefore, this research through the gynogenetic flounder increased homozygosity, as were induced by DH to improve the feasibility of DH induced efficiency; at the same time to age sex the normal development of flounder as control, on gonadotropin and sex steroid hormones in the gonads of DH were determined to flounder, reveal the cause of abnormal DH gonadal development from the perspective of Endocrinology; on the basis of the same family can gonad of fertile and sterile flounder compared proteomics and transcriptomics. Screening differences between fertile and sterile gonad protein and gene expression, and to investigate the molecular mechanism of DH induced by the homozygous male sterile, and search for the protein and gene plays a key role in the work and study can provide 鐢ㄧ殑淇℃伅.涓昏鐮旂┒緇撴灉濡備笅:(1)鍒╃敤鏅，

本文編號(hào)：1385266