發(fā)布時間：2018-01-02 20:25

  本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞microRNA以及病毒小分子RNA抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的作用機制　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病,主要臨床癥狀為各年齡階段豬呼吸道系統(tǒng)疾病和妊娠母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙。PRRSV屬于尼多病毒目、動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬的單股正鏈RNA病毒。自從2006年高致病性PRRSV毒株(HP-PRRSV)所引起以高致病性、高死亡率為特征的高致病性PRRS在我國暴發(fā)以來,HP-PRRSV與低致病性PRRSV毒株(N-PRRSV)處于長期共存狀態(tài),傳統(tǒng)疫苗對其保護(hù)力度不足,迄今對該病仍無確實有效的防制措施,新型抗病毒策略的研究開發(fā)對于PRRSV防控具有重要的意義。PRRSV具有嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性,這一特性主要是由宿主細(xì)胞特異性表達(dá)病毒感染所需的受體蛋白決定的。然而研究證實,PRRSV也能夠在一些非易感細(xì)胞中完成復(fù)制增殖,提示了可能存在已報道受體以外的其他蛋白參與病毒的感染過程。最新的研究發(fā)現(xiàn),非肌肉型肌球蛋白II型重鏈A(Nonmuscle myosin heavy chain-IIA,MYH9)參與了PRRSV感染和病毒粒子運輸?shù)倪^程,通過形成類似于納米管的細(xì)胞間連接能夠?qū)⒉《玖Ｗ訌母腥镜募?xì)胞運送至其他細(xì)胞中,有利于PRRSV逃避宿主的免疫防御。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在PRRSV與細(xì)胞表面受體發(fā)生相互作用后,MYH9引導(dǎo)病毒粒子脫衣殼以及病毒基因組的釋放過程,是PRRSV感染不可或缺的重要分子。但是在病毒感染進(jìn)程中病毒或宿主細(xì)胞對于MYH9的調(diào)控機制目前尚不清楚,仍需要進(jìn)一步研究探索。microRNAs是一類內(nèi)源性表達(dá)的小分子非編碼RNA,通過mRNA降解或者抑制翻譯等途徑在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。研究表明由宿主或者病毒編碼的microRNA作為重要的調(diào)節(jié)因子參與了病毒感染過程中宿主及病毒基因的表達(dá)調(diào)控,在機體免疫應(yīng)答和病毒與宿主相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮極其重要的作用。一方面,病毒感染能夠引起宿主編碼的microRNA表達(dá)水平改變,后者通過靶向病毒或者自身的基因,對病毒生命過程的諸多環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)控,發(fā)揮抗病毒免疫應(yīng)答或者被病毒利用反而利于病毒持續(xù)感染。另一方面,許多病毒同樣可以編碼microRNA調(diào)節(jié)病毒及宿主基因的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控自身感染增殖的生命進(jìn)程。在DNA病毒中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的病毒編碼的microRNA,但關(guān)于RNA病毒所編碼的microRNA報道較少,由于其生物學(xué)加工機制和調(diào)控病毒感染的方式與傳統(tǒng)報道存在差異,目前往往將其歸類于病毒小分子RNA(vsRNAs)。PRRSV作為一種有囊膜的單股正鏈rna病毒,對于prrsv能否編碼病毒micrornas/vsrnas進(jìn)而調(diào)控自身的感染目前還不清楚,需要進(jìn)一步的研究探索。本課題研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.細(xì)胞micrornalet-7f-5p通過靶向myh9抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒在豬肺泡巨噬細(xì)胞中的復(fù)制本研究首先利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測和雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)鑒定,發(fā)現(xiàn)myh9能夠被細(xì)胞micrornalet-7f-5p所調(diào)控,并揭示了let-7f-5p通過特異性結(jié)合于myh93’utr,而發(fā)揮對myh9的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。其次利用let-7f-5p模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染pams,檢測myh9的表達(dá)變化,證實了let-7f-5p調(diào)控myh9表達(dá)是同時以mrna降解和抑制蛋白翻譯兩種途徑調(diào)控myh9表達(dá)。然后,通過基于莖環(huán)引物的實時定量pcr方法,檢測了不同毒力prrvs感染的pams中l(wèi)et-7f-5p的動態(tài)變化規(guī)律,我們發(fā)現(xiàn)let-7f-5p在prrsv感染后表達(dá)水平顯著下調(diào),其靶基因myh9的表達(dá)存在上調(diào)趨勢。最后,研究證明了宿主細(xì)胞micrornalet-7f-5p能夠通過靶向myh9有效抑制不同毒力prrsv在pams中的復(fù)制,利用let-7f-5p過表達(dá)的技術(shù)能夠有效的防控prrsv的感染,此研究為利用宿主細(xì)胞的microrna防控prrsv的感染提供了實驗依據(jù)。2.prrsv編碼的病毒小分子rna通過靶向nsp2抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒在豬肺泡巨噬細(xì)胞中的復(fù)制本研究首先發(fā)現(xiàn)所預(yù)測的四個具有典型莖環(huán)結(jié)構(gòu)的vsrnas前體分別位于prrsv基因組的orf1a,orf1b以及gp2a區(qū)域。其中,prrsv-vsrna1前體具有最低的自由能(mfe)代表其能夠形成較為穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu),由此選擇prrsv-vsrna1進(jìn)行深入研究。利用northernblot及小rna克隆測序的方法,證實了在prrsv感染的pams中prrsv-vsrna1的存在。其次利用基于莖環(huán)引物的實時定量pcr方法檢測prrsv-vsrna1在prrsv感染周期中的動態(tài)變化,我們發(fā)現(xiàn)prrsv-vsrna1的表達(dá)存在與prrsv感染進(jìn)程相一致的趨勢。為了探索prrsv-vsrna1所發(fā)揮的生物學(xué)功能,我們分別利用人工合成的prrsv-vsrna1抑制物和模擬物轉(zhuǎn)染prrsv易感細(xì)胞后進(jìn)行病毒感染檢測,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染其抑制物能夠顯著促進(jìn)prrsv在pams中的復(fù)制,而轉(zhuǎn)染其模擬物能夠顯著抑制prrsv在pams中的復(fù)制。然后通過對microrna通路中關(guān)鍵蛋白的基因敲低試驗,證實了prrsv-vsrna1的生物學(xué)加工過程依賴兩種細(xì)胞蛋白drosha和ago2,而不依賴dicer和rnasel的參與。最后,利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測和雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng),我們鑒定了prrsv-vsrna1發(fā)揮調(diào)控作用的靶基因,發(fā)現(xiàn)prrsv-vsrna1能夠特異性地結(jié)合到prrsv基因組中非結(jié)構(gòu)蛋白2(nsp2)區(qū)域,從而抑制prrsv的感染,此研究為利用源于病毒的小分子rna防控prrsv的感染提供了實驗依據(jù)。綜上所述,本研究一方面從宿主的角度證實了細(xì)胞內(nèi)源性micrornalet-7f-5p能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞myh9基因的表達(dá),從而在prrsv的感染過程中發(fā)揮重要作用;另一方面從病毒的角度出發(fā),發(fā)現(xiàn)并證實了源于PRRSV基因組的PRRSV-vsRNA1能夠靶向PRRSV的NSP2基因而負(fù)調(diào)控PRRSV的感染進(jìn)程。揭示了PRRSV能夠利用microRNA的調(diào)節(jié)機制在感染過程中調(diào)節(jié)宿主及病毒基因的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控病毒的復(fù)制和增殖。過表達(dá)let-7f-5p與PRRSV-vsRNA1則分別通過抑制宿主的MYH9基因以及病毒的NSP2的表達(dá)從而發(fā)揮抗病毒作用。本研究為深入了解PRRSV感染過程中microRNA介導(dǎo)的病毒與宿主的相互作用以及細(xì)胞microRNA和源于病毒的vsRNAs在PRRSV防控中的作用,提供了全新的視角和策略。
[Abstract]:Porcine reproductive and respiratory syndrome ( PRRS ) is a kind of viral infectious disease caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virus ( PRRS ) . In order to explore the biological functions of prrsv - vsrna1 , prrsv - vsrna1 can be effectively inhibited by prrsv - vsrna1 .

【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：1370793