本文關(guān)鍵詞：柑橘純合種質(zhì)創(chuàng)制及早金甜橙DH系代謝與轉(zhuǎn)錄組分析　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：純系材料在植物育種及基因組學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。然而,由于柑橘具有高度雜合性、童期長(zhǎng)、樹(shù)體龐大、珠心胚和某些品種自交不親和等特性,采用常規(guī)育種途徑在柑橘上很難獲得純合種質(zhì)。誘導(dǎo)配子體胚胎發(fā)生,包括花藥培養(yǎng)、小孢子離體培養(yǎng)、誘導(dǎo)孤雌生殖、離體子房培養(yǎng)等,可以直接獲得完全的純系材料,省時(shí)省力。自上世紀(jì)70年代,柑橘通過(guò)誘導(dǎo)配子體胚胎發(fā)生已獲得一些純合材料,然而這些純系大都具有相似的遺傳背景,且都存在再生困難的問(wèn)題,使得柑橘純系種質(zhì)資源種類及數(shù)量無(wú)法達(dá)到應(yīng)用的要求,限制了柑橘純系材料的應(yīng)用。本文通過(guò)花藥培養(yǎng)和誘導(dǎo)孤雌生殖的方法,創(chuàng)造柑橘純系種質(zhì),以拓展柑橘純合種質(zhì)資源類型及數(shù)量;對(duì)早金甜橙及其DH系進(jìn)行芳香烴代謝及轉(zhuǎn)錄組差異分析,評(píng)價(jià)其單倍化過(guò)程中代謝及基因表達(dá)變化。主要結(jié)果如下:1、花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)柑橘純系。通過(guò)四種誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)15個(gè)柑橘品種進(jìn)行花藥培養(yǎng)誘導(dǎo),并對(duì)誘導(dǎo)獲得的全部胚狀體及愈傷組織進(jìn)行倍性及分子標(biāo)記鑒定,獲得了早金甜橙(Citrus sinensis Osbeck)單倍體系15個(gè),純合二倍體系10個(gè)(其中2個(gè)DH系已再生植株,為甜橙純合植株誘導(dǎo)成功的首次報(bào)道),同源四倍體系2個(gè);紅夏橙(C.sinensis Osbeck)單倍體愈傷組織系1個(gè);暗柳橙(C.sinensis Osbeck)單倍體愈傷組織系2個(gè);雞尾葡萄柚(C.paradis Macf.)單倍體愈傷組織系1個(gè)(為葡萄柚純系誘導(dǎo)成功的首次報(bào)道)。利用均勻分布于柑橘9條染色體的31對(duì)SSR引物對(duì)早金甜橙16個(gè)純系的遺傳組成進(jìn)行深入分析,證實(shí)這些純系的純合性為100%,并且起源于不同基因型的小孢子;通過(guò)對(duì)其帶型統(tǒng)計(jì)進(jìn)行小孢子等位基因分離規(guī)律分析,表明在29個(gè)雙帶位點(diǎn)中,有16個(gè)位點(diǎn)的等位基因分離遵循1:1的分離規(guī)律。2、誘導(dǎo)孤雌生殖創(chuàng)制柑橘純系。利用γ射線輻射的枳(Poncirus trifoliata Raf.)和銅城72-1錦橙(C.sinensis Osbeck)不同輻射劑量的花粉對(duì)HB柚(C.grandis Osbeck)、高班柚(C.grandis Osbeck)、鳳凰柚(C.grandis Osbeck)、華農(nóng)紅柚(C.grandis Osbeck)、秋輝橘橙([C.reticulata Blanco×(C.paradis Macf.×C.reticulata Blanco)]×(C.reticulata Blanco×C.sinensis Osbeck))以及尤力克檸檬(C.limon Burm.f.)6個(gè)柑橘單胚或者單多胚混合品種授粉誘導(dǎo)孤雌生殖。花粉活力檢測(cè)表明輻射對(duì)花粉活力沒(méi)有影響;授粉后對(duì)花粉管行為進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),輻射后的花粉管可以正常萌發(fā)伸長(zhǎng)至胚珠。經(jīng)胚挽救,對(duì)獲得的植株進(jìn)行倍性及分子標(biāo)記鑒定,確定獲得HB柚單倍體4株,同時(shí)由HB柚×255Gy枳授粉組合獲得三倍體1株、由華農(nóng)紅柚×500Gy枳授粉組合獲得三倍體1株。核型分析和分子標(biāo)記確定了HB柚單倍體來(lái)源于孤雌生殖。3、三倍體花粉誘導(dǎo)孤雌生殖。利用三倍體葡萄柚Melgold(C.paradis Macf.)與Oroblanco(C.paradis Macf.)的花粉對(duì)HB柚、高班柚、鳳凰柚、華農(nóng)紅柚、秋輝及沙田柚(C.grandis Osbeck)6個(gè)柑橘單胚品種授粉誘導(dǎo)孤雌生殖,通過(guò)胚挽救并對(duì)獲得的植株進(jìn)行倍性鑒定,確定由HB柚×Melgold授粉組合獲得三倍體植株7株,由高班柚×Melgold授粉組合獲得三倍體1株,由秋輝×Oroblanco三倍體組合獲得四倍體1株。4、早金甜橙及其DH系芳香烴代謝及轉(zhuǎn)錄組差異分析。對(duì)早金甜橙及其DH系葉片進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析,其葉面積、翼葉面積、葉面積與翼葉面積比及葉形指數(shù)均存在顯著性差異。通過(guò)GC-MS對(duì)芳香烴代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定分析,共檢測(cè)到45種芳香烴類化合物,其中42種物質(zhì)含量存在顯著性差異;在DH系,其總含量高于早金甜橙,含量上調(diào)積累的有12種,含量下調(diào)積累的有30種,其中20種物質(zhì)未檢測(cè)到。通過(guò)RNA-seq對(duì)基因表達(dá)差異進(jìn)行分析,以FDR≤0.001且表達(dá)量≥2倍為篩選標(biāo)準(zhǔn),共篩選到差異表達(dá)基因1863個(gè),占總基因量的5.77%;其中DH系上調(diào)表達(dá)基因506個(gè)(占總差異基因的27.16%),下調(diào)表達(dá)基因1357個(gè)(占總差異基因的72.84%)。這些差異基因主要參與防御、逆境及刺激響應(yīng)、代謝及細(xì)胞死亡等生物過(guò)程,其中上調(diào)表達(dá)差異基因還參與芳香化合物合成過(guò)程,這可能是引起DH系芳香烴代謝差異的主要原因。
[Abstract]:Pure lines play an important role in plant breeding and genomics research. However, due to the citrus highly heterozygous, long juvenile period, large tree, nucellar embryo and some varieties of self incompatibility and other characteristics, using conventional breeding in citrus. It is difficult to obtain a homozygous gametophyte embryo induction. Happen, including anther culture, isolated microspore culture, parthenogenesis, ovary culture in vitro, can directly obtain pure lines, complete time-saving. Since the last century in 70s, through the induction of embryogenesis in Citrus gametophyte has obtained some homozygous materials, however, most of these homozygous lines with similar genetic background, and there is regeneration difficult problem, the pure citrus Germplasm resources types and quantity cannot meet the application requirements, limit the application of Citrus pure lines. This paper through anther culture and induction of parthenogenesis, Pure creation of Citrus germplasm, to develop citrus germplasm resources of homozygous type and quantity of earlygold sweet orange; and its DH system to analyze the differences of aromatic hydrocarbon metabolism and transcriptome, metabolism and gene expression to evaluate its haploid process. The main results are as follows: 1. The induction of Citrus pure induction medium for anther culture. The 15 varieties of Citrus anther culture induced by four, and ploidy and molecular marker identification of embryoid and callus induction of the earlygold sweet orange (Citrus sinensis Osbeck) system of 15 haploid, 10 homozygous diploid lines (DH lines have been reported for the first time in 2 regeneration plants. For the orange homozygous plants successfully induced), which is four times the 2 homologous system; red Valencia Orange (C.sinensis Osbeck) haploid callus line 1; anliucheng (C.sinensis Osbeck) haploid callus line 2; chicken tail grapefruit (C.paradis Macf.) Haploid callus line 1 (for the first time reported for grapefruit pure lines successfully induced). Using 31 pairs of SSR primers were evenly distributed on 9 chromosomes of Citrus genetic earlygold sweet orange 16 pure lines composed of in-depth analysis, confirmed the homozygosity of these homozygous lines was 100%, and the microspore originated from different genotypes; through the band type statistics allele separation law of microspore analysis, show that in 29 pairs of loci, 16 alleles from.2 follow the separation law of 1:1, parthenogenesis create citrus pure lines. Using gamma ray radiation (Poncirus trifoliata Raf.) and Poncirus Tongcheng 72-1 Jincheng orange (C.sinensis Osbeck) with different radiation doses of pollen (C.grandis Osbeck), HB grapefruit pomelo (C.grandis Osbeck), high (C.grandis Osbeck), Phoenix pummelo (C.grandis Osbeck) Huanong red grapefruit, orange orange ([C.reticulata Blanco Qiu Hui * (C.paradis Macf. * C.reticulata * Blanco)] (C.reticulata) Blanco * C.sinensis Osbeck) and Eureka Lemon (C.limon Burm.f.) 6 citrus single embryo or single hybrid varieties of Polyembryonic pollination induced parthenogenesis. Pollen viability test showed that radiation had no effect on pollen viability; after pollination of pollen tube behavior were observed, the radiation tube normal germination extends to the ovule. Through embryo rescue, ploidy and molecular marker identification of plants, obtained 4 strains of HB pummelo haploid, and by HB pummelo * 255Gy trifoliate pollination combination to obtain triploid 1 strains by Huanong red grapefruit 500Gy * trifoliate pollination combination to obtain triploid 1 strains. Karyotype analysis and molecular marker determination HB grapefruit originated from the parthenogenesis haploid.3, parthenogenesis induced triploid pollen. The triploid of Melgold (C.paradis Macf.) and grapefruit Oroblanco (C.paradis Macf.) pollens of HB pummelo, Phoenix High pomelo, pomelo, Huanong red grapefruit, autumn Hui (C.grandis Osbeck) Shatinyu and 6 citrus Monogerm varieties pollination induced parthenogenesis, through embryo rescue and ploidy identification of the plant, determined by the combination of HB pummelo * Melgold pollination to obtain triploid 7 strains by the combination of high class pummelo * Melgold pollination obtain triploid tetraploid 1 strains, 1 strains of.4 by the combination of autumn Hui * Oroblanco triploid, difference analysis of aromatic hydrocarbon metabolism and transcription group earlygold sweet orange and DH. Morphological analysis of earlygold sweet orange and DH leaves, leaf area, wing leaf area, leaf area and leaf area ratio and leaf index were wing there was a significant difference. The GC-MS for aromatic metabolites were identified and analyzed, 45 kinds of aromatic compounds were detected, of which there is a significant difference between the 42 kinds of substances; in DH, the total content is higher than that of earlygold sweet orange, raised the content of accumulation There are 12 kinds of content, reduced accumulation of 30 species, including 20 kinds of substances were not detected. Through the analysis of the differences on the expression of RNA-seq gene in FDR is less than or equal to 0.001 and the expression amount is greater than or equal to 2 times the screening criteria were screened 1863 differentially expressed genes, the total amount of gene 5.77%; wherein DH is raised the expression of 506 genes (total differential gene 27.16%), down regulate the expression of 1357 genes (total 72.84% differentially expressed genes). These genes were mainly involved in defense, stress and stimulation response, metabolism and cell death and other biological processes, which up-regulated differentially expressed gene is also involved in the synthesis process of aromatic compounds, which may be mainly caused by the the reason of DH aromatic hydrocarbon metabolism differences.

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S666

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