本文關(guān)鍵詞：Hfq對肺炎克雷伯菌耐藥性影響和機(jī)制初探及Hfq抑制劑虛擬篩選　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae)是一種革蘭氏陰性菌,在自然界中分布廣泛,能夠引起人類和動(dòng)物的肺炎、尿路感染、細(xì)菌性腦膜炎和敗血癥,以及多種呼吸道和胃腸道疾病,是重要的人獸共患病病原體。尤其是近年來,肺炎克雷伯菌(簡稱為肺克菌)被認(rèn)定為是一類嚴(yán)重的多藥物耐藥菌,同時(shí)因?yàn)槠湓谌蚍秶鷥?nèi)傳播,從而引發(fā)了重大的公共衛(wèi)生問題,對人類和動(dòng)物的身體健康和生命安全造成了巨大威脅。肺克菌的耐藥情況目前非常嚴(yán)重。該菌是碳青霉烯類抗生素耐藥菌感染的主要病原體之一,同時(shí)對第三代頭孢菌素類藥物耐藥嚴(yán)重,可以說對于該菌的治療已經(jīng)近乎面臨無藥可用的地步。肺克菌是一類分布廣泛、致病譜廣的機(jī)會(huì)致病菌,鑒于其在臨床上的耐藥情況異常嚴(yán)峻,探究肺克菌耐藥機(jī)制,為臨床治療肺克菌感染開辟新的途徑具有重要意義。Hfq蛋白是細(xì)菌基因表達(dá)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子,它能介導(dǎo)s RNA與m RNA之間的相互作用,影響m RNA的穩(wěn)定性,促進(jìn)或阻礙m RNA翻譯。這種基因調(diào)控機(jī)制對細(xì)菌是至關(guān)重要的,能夠影響細(xì)菌多種細(xì)胞過程和生理生化反應(yīng),尤其是對宿主菌的生長、代謝及毒力等方面都具有重要調(diào)控作用。Hfq蛋白對肺克菌基因表達(dá)有全局性影響,本實(shí)驗(yàn)探究該蛋白對肺克菌耐藥性影響及其調(diào)控機(jī)制無疑對更加深入理解肺克菌耐藥性的形成過程具有重要意義,同時(shí)也可能為研究開發(fā)防治肺克菌感染性疾病的藥物提供新的思路。本實(shí)驗(yàn)中首先利用基于Red-重組系統(tǒng)方法將hfq基因敲除,構(gòu)建肺克菌hfq突變株。然后通過藥物敏感性試驗(yàn),考察肺克菌野生株和hfq突變株藥物敏感性的差異,說明hfq對肺克菌耐藥性的影響。Δhfq株對頭孢菌素類藥物、美羅培南、左氧氟沙星、替加環(huán)素、阿奇霉素、嗎啉VA酮的耐藥性均比野生株耐藥性有所上升,對多肽類藥物和利福平的藥物敏感性與野生株一致,而對氨基糖苷類藥物的藥物敏感性有所下降。研究中同時(shí)構(gòu)建了Δhfq回復(fù)株,其耐藥性和野生株基本一致。本研究選擇了頭孢菌素類藥物進(jìn)行時(shí)間-殺菌曲線試驗(yàn),說明Δhfq株在更高濃度的頭孢菌素類藥物下的存活能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于野生株的存活能力,進(jìn)一步證明了hfq的突變會(huì)導(dǎo)致肺克菌對頭孢菌素類藥物耐藥性的增強(qiáng)。鑒于Hfq是全局性調(diào)控因子,本實(shí)驗(yàn)考察了與肺克菌耐藥性密切相關(guān)的外排泵基因acr B和oqx B及其調(diào)控因子ram A、mar A、sox S,主要外膜孔道蛋白Omp35、Omp36在野生株和Δhfq株中的表達(dá)情況,同時(shí)還用結(jié)晶紫染色定量法檢測了野生株和Δhfq株形成生物被膜的能力。結(jié)果表明,相對野生株,acr B、oqx B、sox S和mar A表達(dá)量均有所升高,外膜蛋白Omp35基因表達(dá)量下降而Omp36基因表達(dá)量有所上升,同時(shí)Δhfq株生物被膜的形成能力顯著增強(qiáng)。鑒于對頭孢菌素類藥物耐藥性變化較大,本實(shí)驗(yàn)還利用熒光定量PCR的方法分析了青霉素結(jié)合蛋白在Δhfq株和野生株中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺克菌中主要的9種PBPs,除了PBP4的表達(dá)量略有上升外,其余8種PBPs的表達(dá)量均有所下降,尤其是PBP6b和PBP7,下降具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),說明這兩種PBPs受到Hfq蛋白的調(diào)控作用較強(qiáng),暗示他們參與了Hfq蛋白對頭孢菌素類藥物耐藥性的調(diào)控。細(xì)菌中Hfq蛋白對基因的調(diào)控作用主要是透過介導(dǎo)s RNA和m RNA之間的相互作用來實(shí)現(xiàn)的。對肺克菌s RNA進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)新的s RNA或者s RNA新的功能,將在新的層次中對Hfq蛋白調(diào)控肺克菌耐藥機(jī)制有更進(jìn)一步的理解,同時(shí)也有望為肺克菌疾病藥物的研發(fā)提供新的思路。本研究利用生物信息學(xué)方法,在肺克菌中共預(yù)測出了59條候選s RNA序列。通過PCR和RT-PCR的方法,驗(yàn)證出32個(gè)候選s RNA。為了進(jìn)一步確定這些候選s RNA中哪些與肺克菌耐藥性相關(guān),本實(shí)驗(yàn)研究利用半定量比較分析的方法考察這些候選s RNA在不同抗生素處理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)錄本豐度,從而發(fā)現(xiàn)與肺炎克雷伯菌耐藥性相關(guān)的s RNA。頭孢菌素和氨基糖苷類抗生素聯(lián)用是目前臨床上治療肺克菌感染的常見用藥方案。盡管hfq突變株對頭孢菌素耐藥性升高,但對氨基糖苷類藥物耐藥性卻有所降低。還有,肺克菌生物被膜對氨基糖苷類抗生素的耐藥程度與懸浮菌相同,說明降低這類抗生素的用藥濃度會(huì)有效降低治療生物被膜產(chǎn)生感染的用藥劑量。同時(shí),肺克菌hfq突變株的毒力和侵襲力大幅減弱,因此,Hfq蛋白抑制劑與氨基糖苷類藥物的聯(lián)合使用有望成為臨床治療肺克菌感染的有效策略。本研究利用以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計(jì)方法,通過同源模建、活性位點(diǎn)預(yù)測及分子對接的方法在小分子化合物的類藥性化合物庫中對肺克菌Hfq抑制劑進(jìn)行篩選。依據(jù)小分子配體和受體蛋白的結(jié)合能以及ADMET檢測結(jié)果,篩選得到10個(gè)具有Hfq抑制活性的候選分子。其中ZINC25147445具有最低結(jié)合能為-11.4kcal/mol。通過Autodock軟件進(jìn)行分子對接以考察具有最低結(jié)合能的三個(gè)小分子ZINC25147445、ZINC35363745和ZINC20859128抑制Hfq蛋白的分子機(jī)制。結(jié)果顯示小分子配體和Hfq蛋白之間存在著疏水作用力、氫鍵和π-π堆積力。其中Hfq蛋白上的GLN8,GLN41,PHE42,TYR55,LYS56和HIS57是主要的結(jié)合位點(diǎn)。綜上所述,Hfq對肺克菌耐藥性具有重要影響。這種影響是Hfq通過調(diào)控肺克菌外排泵表達(dá)、外膜孔道蛋白表達(dá)、生物被膜形成以及藥物靶標(biāo)表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的,是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)利用生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法發(fā)現(xiàn)肺克菌內(nèi)可能存在的與肺克菌耐藥相關(guān)的s RNA,Hfq對肺克菌耐藥性的調(diào)控是否通過這些s RNA來實(shí)現(xiàn)是下一步研究的重點(diǎn)方向。此外,本實(shí)驗(yàn)還依靠計(jì)算機(jī)手段虛擬篩選出一批Hfq潛在抑制劑,期望為研發(fā)防治肺克菌感染藥物開辟新思路。這些發(fā)現(xiàn)與研究為進(jìn)一步闡明肺克菌耐藥機(jī)理提供基礎(chǔ),同時(shí)為臨床研發(fā)抗肺克菌感染藥物提供了新的策略。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1349816