本文關(guān)鍵詞：華蟾毒精對先天免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用研究　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：先天免疫作為機體抵抗感染最重要的第一步,能有效鎖定微生物,控制并進而清除感染。免疫系統(tǒng)中的非特異性免疫細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等),還有一些非細(xì)胞成分(如補體和抗菌肽等),以及機體與外界間的生理屏障共同構(gòu)成了機體的先天免疫系統(tǒng)。先天免疫失調(diào)或缺陷會增加宿主對細(xì)菌、病毒及真菌等的易感性。實踐及臨床研究證明中藥具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能。而樹突狀細(xì)胞是連接機體先天免疫與后天免疫之間的橋梁,故可能成為研究中藥免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵。蟾酥作為我國傳統(tǒng)中藥,具有開竅止痛、解毒消腫之功效,目前已廣泛用于治療多種頑固性疾病,如呼吸道感染、慢性阻塞性肺病、乙型肝炎及流行性腮腺炎等。華蟾毒精(CBG)作為蟾酥主要有效成分之一,具有強心、止痛、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性。然而,有關(guān)華蟾毒精對先天免疫細(xì)胞尤其是對樹突狀細(xì)胞作用的報道卻非常有限。本文主要探討了華蟾毒精對先天免疫相關(guān)細(xì)胞尤其是樹突狀細(xì)胞免疫功能的影響,為該藥物及蟾酥的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。首先,通過質(zhì)譜和內(nèi)毒素含量檢測方法對所用CBG質(zhì)量進行了評價,發(fā)現(xiàn)本課題中所用CBG質(zhì)量可靠且無內(nèi)毒素污染,為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。其次,通過粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)對外周血中提取到的單核細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化的方法得到原代樹突狀細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光染色、實時變形流式、ELISA、Western Blot、實時熒光定量PCR等方法分別檢測了華蟾毒精對樹突狀細(xì)胞活性、機械表型、caspase酶活性、抗原攝取、抗原遞呈、細(xì)胞因子分泌、抗菌肽表達(dá)、殺菌作用等多方面的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CBG并不能引起細(xì)胞壞死,但是高劑量CBG(1?g/ml)可誘導(dǎo)部分細(xì)胞凋亡,而這種凋亡與多種Caspase酶活化有關(guān)。純化的樹突狀細(xì)胞通過實時變形流式得到的兩個種群對CBG的敏感性不同,而且反應(yīng)方向也不同。同時發(fā)現(xiàn)CBG抑制了樹突狀細(xì)胞對肺炎鏈球菌的吞噬能力,抑制了LPS誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞成熟,包括下調(diào)MHC II類分子、CD80及CD86表面蛋白的表達(dá)及抑制細(xì)胞因子IL-6、IL-8、IL-12、腫瘤壞死因子(TNF)-α等的分泌。然而,CBG卻能顯著促進IL-1β的表達(dá)與分泌,且這種促分泌作用與caspase-1酶的活化有關(guān)。此外,CBG能促進樹突狀細(xì)胞抗菌肽β防御素-2(h BD-2)和3(h BD-3)的表達(dá),同時改善LPS對抗菌肽分泌的抑制作用。CBG刺激后的樹突狀細(xì)胞上清液對肺炎鏈球菌具有一定抑菌作用,而CBG本身并沒有直接的抑菌效果。為了進一步闡明CBG對樹突狀細(xì)胞功能的作用機制,我們在第二章中利用RT2 profiler PCR array技術(shù)分別檢測了其對樹突狀細(xì)胞Toll樣受體(TLRs)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(84個相關(guān)基因)及炎性小體通路(84個相關(guān)基因)相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):華蟾毒精能明顯影響樹突狀細(xì)胞炎癥小體通路及Toll樣受體信號傳導(dǎo)通路中多種基因的表達(dá)。通過促進P2X7受體、NOD樣受體NLRP1及NF-k B相關(guān)基因表達(dá)來激活炎性小體信號通路,可能是華蟾毒精造成樹突狀細(xì)胞caspase-1活化與IL-1β分泌而觸發(fā)炎癥反應(yīng)的作用機制。同時,華蟾毒精也能降低TLR5、TLR2、TLR8、NLRC4及CD14等多種模式識別受體相關(guān)基因的表達(dá),且促進NFKBIA等NF-κB抑制蛋白的相關(guān)基因表達(dá),從而控制過度炎癥反應(yīng)。鑒于本實驗中所用樹突狀細(xì)胞為外周血單核細(xì)胞來源,故第三章就CBG對原代單核細(xì)胞免疫功能的影響進行了研究,同時也評價了其對THP-1單核細(xì)胞系的作用。通過LDH檢測細(xì)胞毒性,ELISA檢測上清中不同細(xì)胞因子及抗菌肽分泌水平,流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞casapase-1酶活性及實時熒光定量PCR檢測相關(guān)基因表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CBG對原代單核細(xì)胞毒性較弱,但是對癌癥來源的THP-1單核細(xì)胞系毒性明顯;CBG在1?g/m L濃度時能顯著提高原代單核細(xì)胞分泌IL-1β,與對照組相比升高51倍;在0.1?g/m L及1?g/m L濃度時均能顯著提高原代單核細(xì)胞分泌IL-8,其中0.1?g/m L濃度時IL-8分泌升高21倍;CBG單獨作用不能誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌IL-1β,但與LPS聯(lián)合作用后,IL-1β分泌量有所升高;CBG不能誘導(dǎo)原代單核細(xì)胞抗菌肽h BD2、h BD3及LL-37的表達(dá),但可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)并分泌h BD2及h BD3。第四章就CBG對中性粒細(xì)胞免疫功能的影響進行了研究。通過LDH法檢測細(xì)胞活性,ELISA檢測上清中細(xì)胞因子及抗菌肽HNP1-3分泌水平,Western Blot檢測上清中抗菌肽h CAP18/LL-37分泌水平,實時熒光定量PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)水平,以及菌落計數(shù)檢測抑菌作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),CBG對中性粒細(xì)胞沒有毒性且對主要細(xì)胞因子生成無明顯影響,能顯著促進抗菌肽HNP1-3及h CAP18/LL37的分泌,且經(jīng)CBG作用后的中性粒細(xì)胞對肺炎鏈球菌的抑菌作用明顯增強�？紤]到免疫系統(tǒng)是一個整體且免疫細(xì)胞之間存在復(fù)雜而緊密的聯(lián)系,故最后以全血及外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)為研究對象,初步探討了華蟾毒精對血液中多種細(xì)胞的整體作用。通過LDH法檢測細(xì)胞毒性,并通過ELISA法檢測細(xì)胞因子分泌水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CBG對全血及PBMCs細(xì)胞無明顯毒性;CBG單獨可誘導(dǎo)全血分泌IL-1β并可提高LPS誘導(dǎo)的IL-1β分泌;盡管CBG單獨不能誘導(dǎo)PBMCs分泌IL-1β,但可提高LPS誘導(dǎo)的IL-1β分泌量;CBG極顯著抑制LPS誘導(dǎo)的PBMCs分泌IL-10和IL-8;CBG在0.01?g/m L濃度時對PHA誘導(dǎo)的IFN-γ分泌有升高趨勢,但差異不顯著,而1?g/m L濃度時則顯著性抑制該分泌。綜上所述,華蟾毒精能針對樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等不同的先天免疫細(xì)胞的功能進行有效調(diào)節(jié)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S853.7
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本文編號：1334751