本文關(guān)鍵詞：玉米赤霉烯酮免疫學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)研究　出處：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是由鐮刀菌分泌的一類真菌毒素,功能與雌激素類似,無論在田間的谷物上,還是在貯藏的谷物及谷物制品(包括食品及飼料)中都可以檢測(cè)到。ZEN可以活化雌激素受體,從而損害動(dòng)物的生殖系統(tǒng),由于ZEN中毒事件頻繁發(fā)生,引起了獸醫(yī)界的廣泛關(guān)注。動(dòng)物攝食被ZEN污染的飼料后,可能導(dǎo)致“高雌激素綜合癥”,肝毒性、細(xì)胞毒性、免疫毒性和致腫瘤等多種毒害作用,給畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重威脅動(dòng)物及人類健康,給獸醫(yī)、畜牧養(yǎng)殖管理部門及食品安全監(jiān)管部門帶來了巨大的壓力,因此很多國(guó)家都對(duì)糧食及飼料中ZEN制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn),并研究其快速、準(zhǔn)確及敏感的監(jiān)測(cè)方法。免疫學(xué)分析技術(shù)因其具有靈敏,特異,快速及高通量等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于真菌毒素污染的快速檢測(cè)中。為了獲得特異、靈敏的ZEN免疫學(xué)快速檢測(cè)方法,本研究對(duì)ZEN的分子結(jié)構(gòu)、人工抗原的偶聯(lián)方法等進(jìn)行了分析,通過動(dòng)物免疫及細(xì)胞融合,篩選出分泌ZEN單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,并通過體內(nèi)誘生腹水法制備了抗ZEN的單克隆抗體,對(duì)其免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定,進(jìn)一步組裝了ZEN ELISA快速檢測(cè)試劑盒、ZEN膠體金免疫層析試紙及同步檢測(cè)赭曲霉毒素A(OTA)及ZEN的膠體金免疫層析試紙,主要實(shí)驗(yàn)分析及結(jié)果如下。1.ZEN人工抗原的制備根據(jù)ZEN的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),將1,4-丁二醇二縮水甘油醚法初次用于ZEN人工抗原的偶聯(lián)中,制備了人工抗原ZEN-BSA及ZEN-OVA,經(jīng)紫外光譜法及SDS-PAGE法初步鑒定人工抗原偶聯(lián)成功。免疫6只小鼠進(jìn)行人工抗原的免疫原性鑒定,結(jié)果5只小鼠產(chǎn)生了ZEN的抗體,從而證明了人工抗原ZEN-BSA制備成功,且具有很好的免疫原性。2.ZEN單克隆抗體的制備與鑒定選擇免疫性較好的小鼠,取其脾臟,經(jīng)細(xì)胞融合、亞克隆、ELISA篩選等方法,得到了能穩(wěn)定分泌ZEN單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株4株,并分別命名為:3G10、4A3-A10、4A3-F9、4F11-H5。經(jīng)體內(nèi)誘生腹水法得到了相應(yīng)的腹水,辛酸硫酸銨法純化腹水,對(duì)單抗進(jìn)行免疫學(xué)特性鑒定,經(jīng)鑒定4株單抗亞型均為IgG1型;ELISA效價(jià)均達(dá)到10-5以上;IC50分別為1.2972ng/m L、1.1657ng/m L、1.1149 ng/m L、1.3091 ng/mL;親和常數(shù)分別為4.5×1010L/mol、9.21×1010 L/mol、3×1011 L/mol和6.5×1010 L/mol;經(jīng)抗體特異性鑒定,結(jié)果顯示4A3-F9抗體特異性較好,與ZAN有53.121%的交叉,與另外4種結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率都小于4%;另外3株單抗與ZAN交叉反應(yīng)在75.945%-93.569%,與另外4種結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率都小于10%;4株單抗與常見真菌毒素和載體蛋白的交叉反應(yīng)率都小于0.02%。3.玉米赤霉烯酮ELISA快速檢測(cè)試劑盒的研制利用ZEN單克隆抗體4A3-F9研制了ZEN ELISA快速檢測(cè)試劑盒。試劑盒經(jīng)優(yōu)化后,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好,回歸方程為:y=-0.5636x+0.5706,R~2=0.9922,檢測(cè)限為0.2761ng/m L,IC50為1.3315ng/mL,試劑盒的檢測(cè)范圍在0.2761-6.8362 ng/mL,批內(nèi)、批間變異系數(shù)均在10%以下,室溫可穩(wěn)定保存1年以上,具有良好的精密度及穩(wěn)定性。選用75%的甲醇為提取液,在玉米及飼料中的平均回收率大于90%,檢測(cè)限為3.3132μg/kg。綜上所述,該ZEN ELISA檢測(cè)試劑盒可以用于谷物及飼料中ZEN污染的檢測(cè)。4.玉米赤霉烯酮膠體金免疫層析試紙的研制利用ZEN單克隆抗體4A3-F9組裝ZEN膠體金免疫層析試紙,并對(duì)試紙進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化和性能鑒定。經(jīng)鑒定ZEN試紙的目測(cè)靈敏度為20 ng/m L;借助BioDot-TSR3000讀條儀進(jìn)行ZEN的定量檢測(cè),掃描不同ZEN濃度的試紙檢測(cè)線灰度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到的線性回歸方程為y=-0.6536x+0.8526,R~2=0.9898,經(jīng)計(jì)算,試紙定量檢測(cè)的IC50為3.4632ng/m L,檢測(cè)限為0.8462 ng/mL。玉米樣品中添加回收率為91.30%-97.07%,批內(nèi)最大變異系數(shù)為5.32%,批間最大變異系數(shù)為4.84%,批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于10%;經(jīng)加速穩(wěn)定試驗(yàn)證明,該試紙室溫可穩(wěn)定保存1年以上;并通過與HPLC法確證,本試驗(yàn)制備的ZEN膠體金免疫層析試紙可以用于天然樣品中ZEN污染物的檢測(cè),且具有較高的準(zhǔn)確性。5.同步檢測(cè)赭曲霉毒素A及玉米赤霉烯酮的膠體金免疫層析試紙的研制本試驗(yàn)在ZEN膠體金免疫層析試紙的基礎(chǔ)上結(jié)合OTA單克隆抗體,研制了一種能同步、半定量及定量檢測(cè)玉米、其他谷物及其制品中OTA及ZEN污染物的膠體金免疫層析試紙。結(jié)果顯示,該試紙檢測(cè)OTA及ZEN的目測(cè)靈敏度分別為6 ng/m L和20 ng/mL,借助TSR3000讀條儀可以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè),其對(duì)OTA及ZEN的IC50分別為1.7905 ng/m L和4.3514 ng/m L,檢測(cè)限分別為0.7697 ng/mL和1.2000 ng/mL。用該試紙檢測(cè)天然玉米樣品,并與HPLC檢測(cè)結(jié)果比對(duì),顯示兩種檢測(cè)方法有很好的相關(guān)性,該試紙可以用于同時(shí)、快速、半定量及定量檢測(cè)玉米中OTA及ZEN的污染。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S859.8

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本文編號(hào)：1333905