本文關鍵詞：杜仲種仁轉錄組測序及FAD3基因的鑒定與功能研究　出處：《中國林業(yè)科學研究院》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)為單科單屬單種植物,是我國特有的重要經(jīng)濟樹種和名貴的藥用植物。杜仲適應性強,且廣泛分布于我國北緯27°-42°間的27個省市。杜仲種子的含油率為30%左右,其籽油中含有豐富的α-亞麻酸,含量可高達62%。研究表明FAD3是直接催化亞油酸生成α-亞麻酸的關鍵基因,因此研究EuFAD3基因對探索杜仲種仁中α-亞麻酸合成和高效積累的分子機制以及杜仲的定向遺傳改良具有重要意義。本研究分別以‘華仲6號’和‘華仲10號’花后70 d和160 d的種仁為材料進行轉錄組測序分析,在此基礎上展開了對EuFAD3基因的結構、表達模式、亞細胞定位以及功能等方面的系統(tǒng)研究,主要研究結果如下:1.利用新一代高通量測序技術Illumina HiSeqTM 2000分別對杜仲國審良種‘華仲6號’和‘華仲10號’花后70 d、160 d的種仁共4個樣本進行轉錄組測序分析,共得到72,791,399個高質(zhì)量的序列讀取片段(clean reads),包含了14,702,548,161個(14.70 G)的堿基序列(bp)信息。對reads進行序列組裝,共獲得96,469個平均長度為690 bp的單基因簇(Unigene),序列信息量達到了66.56 Mb。轉錄組數(shù)據(jù)的各項指標均表明測序質(zhì)量較好,且可信度較高。(1)同源性分析結果顯示,有49,856個與其它物種同源的Unigenes得到注釋,占All-Unigene的51.68%;(2)將杜仲轉錄組中的Unigene與GO數(shù)據(jù)庫進行比對分析,根據(jù)其功能可將注釋到的38,983條Unigene分成3大類(細胞組分、分子功能和生物學過程)56個分支;(3)根據(jù)COG功能可將注釋的14,796條Unigene基因劃分成25個類別;(4)KEGG數(shù)據(jù)庫作為參照,可將注釋到的11,260條Unigene定位到117個代謝途徑分支;(5)SSR位點搜索結果顯示,96,469個Unigene中共包含9,621個完整型SSR位點,占總SSR位點的84.14%。完整型SSR位點共包含55種重復基元,其中出現(xiàn)頻率最高的重復基序類型為單核苷酸重復中的A/T(4,597個),其次是AG/CT(2,597個)、AT/AT(439個);本研究首次對杜仲種仁的轉錄組進行了測序分析,這些注釋信息為杜仲種仁發(fā)育過程中相關功能基因的研究提供了重要的依據(jù)和理論參考。2.結合轉錄組數(shù)據(jù)和RACE技術共克隆得到2個FAD3基因,其全長cDNA序列、基因組DNA序列以及啟動子信息如下:(1)EuFAD3-1基因的全長cDNA序列為1,281 bp,共編碼426個氨基酸,氨基酸的分子量為49.18 kDa,等電點為7.43;EuFAD3-1基因組DNA序列的長度為3,151 bp,含有8個內(nèi)含子和9個外顯子;已克隆到EuFAD3-1基因的啟動子長度為2,038 bp;(2)EuFAD3-2基因的全長cDNA序列為1,347 bp,共編碼448個氨基酸,氨基酸的分子量為50.92 kDa,等電點為9.01;EuFAD3-2基因組DNA序列的長度為1,347 bp,無內(nèi)含子;已克隆到EuFAD3-2基因的啟動子長度為2,201 bp。3.以杜仲Actin為內(nèi)參基因,利用熒光定量PCR技術研究FAD3基因分別在‘華仲6號’和‘華仲10號’種仁發(fā)育不同時期中的表達模式:(1)EuFAD3-1基因在‘華仲6號’和‘華仲10號’種仁發(fā)育過程中均是先上升后下降,并分別在花后110 d和150 d達到最大值;(2)FAD3-2基因在‘華仲6號’種仁發(fā)育過程中先上升后下降,最后又上升,并在花后110 d達到最大值;FAD3-2基因在‘華仲10號’種仁發(fā)育過程中先下降后上升至最大值(花后100 d),最后又下降。4.根據(jù)已克隆出來的兩個FAD3基因全長cDNA序列設計特異引物,利用pDNOR222.1載體和含有YFP熒光蛋白的表達載體(nYFP-CD3 686)構建含有目的基因的融合表達載體,電擊法轉化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中,并注射到野生型小葉煙草的葉片中,在LSM510激光共聚焦顯微鏡下用Marker共定位后,觀察目的基因的亞細胞定位情況。結果表明,杜仲兩個FAD3基因均定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。5.采用DNA重組技術成功構建了pCAMBIA1304-35s-EuFAD3-1和pCAMBIA1304-35s-EuFAD3-2兩個植物超表達載體,電擊法轉化到農(nóng)桿菌GV3101中,葉盤法侵染煙草葉片并用抗生素篩選陽性植株。以陽性煙草植株的基因組DNA為模板進行PCR擴增和GUS染色兩種方法鑒定陽性植株,分別得到30株和36株轉基因煙草陽性株/系,分別選取其中的9個株/系的成熟種子通過高效氣相色譜法進行脂肪酸成分分析,結果顯示,相對對照(野生型)而言,pCAMBIA1304-35s-EuFAD3-1和pCAMBIA1304-35s-EuFAD3-2轉化系的煙草種子中α-亞麻酸的含量分別增加了4.27%和0.92%,而亞油酸的含量分別降低了3.86%和0.65%,其他脂肪酸成分變化不顯著。pCAMBIA1304-35s-EuFAD3-1轉基因煙草種子中α-亞麻酸的含量要遠遠高于FAD3-2的。
【學位授予單位】：中國林業(yè)科學研究院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S792.99

【參考文獻】

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本文編號：1332781