本文關(guān)鍵詞：杜仲種仁轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及FAD3基因的鑒定與功能研究　出處：《中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)為單科單屬單種植物,是我國(guó)特有的重要經(jīng)濟(jì)樹種和名貴的藥用植物。杜仲適應(yīng)性強(qiáng),且廣泛分布于我國(guó)北緯27°-42°間的27個(gè)省市。杜仲種子的含油率為30%左右,其籽油中含有豐富的α-亞麻酸,含量可高達(dá)62%。研究表明FAD3是直接催化亞油酸生成α-亞麻酸的關(guān)鍵基因,因此研究EuFAD3基因?qū)μ剿鞫胖俜N仁中α-亞麻酸合成和高效積累的分子機(jī)制以及杜仲的定向遺傳改良具有重要意義。本研究分別以‘華仲6號(hào)’和‘華仲10號(hào)’花后70 d和160 d的種仁為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,在此基礎(chǔ)上展開了對(duì)EuFAD3基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位以及功能等方面的系統(tǒng)研究,主要研究結(jié)果如下:1.利用新一代高通量測(cè)序技術(shù)Illumina HiSeqTM 2000分別對(duì)杜仲國(guó)審良種‘華仲6號(hào)’和‘華仲10號(hào)’花后70 d、160 d的種仁共4個(gè)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,共得到72,791,399個(gè)高質(zhì)量的序列讀取片段(clean reads),包含了14,702,548,161個(gè)(14.70 G)的堿基序列(bp)信息。對(duì)reads進(jìn)行序列組裝,共獲得96,469個(gè)平均長(zhǎng)度為690 bp的單基因簇(Unigene),序列信息量達(dá)到了66.56 Mb。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的各項(xiàng)指標(biāo)均表明測(cè)序質(zhì)量較好,且可信度較高。(1)同源性分析結(jié)果顯示,有49,856個(gè)與其它物種同源的Unigenes得到注釋,占All-Unigene的51.68%;(2)將杜仲轉(zhuǎn)錄組中的Unigene與GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析,根據(jù)其功能可將注釋到的38,983條Unigene分成3大類(細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過程)56個(gè)分支;(3)根據(jù)COG功能可將注釋的14,796條Unigene基因劃分成25個(gè)類別;(4)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)作為參照,可將注釋到的11,260條Unigene定位到117個(gè)代謝途徑分支;(5)SSR位點(diǎn)搜索結(jié)果顯示,96,469個(gè)Unigene中共包含9,621個(gè)完整型SSR位點(diǎn),占總SSR位點(diǎn)的84.14%。完整型SSR位點(diǎn)共包含55種重復(fù)基元,其中出現(xiàn)頻率最高的重復(fù)基序類型為單核苷酸重復(fù)中的A/T(4,597個(gè)),其次是AG/CT(2,597個(gè))、AT/AT(439個(gè));本研究首次對(duì)杜仲種仁的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序分析,這些注釋信息為杜仲種仁發(fā)育過程中相關(guān)功能基因的研究提供了重要的依據(jù)和理論參考。2.結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和RACE技術(shù)共克隆得到2個(gè)FAD3基因,其全長(zhǎng)cDNA序列、基因組DNA序列以及啟動(dòng)子信息如下:(1)EuFAD3-1基因的全長(zhǎng)cDNA序列為1,281 bp,共編碼426個(gè)氨基酸,氨基酸的分子量為49.18 kDa,等電點(diǎn)為7.43;EuFAD3-1基因組DNA序列的長(zhǎng)度為3,151 bp,含有8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子;已克隆到EuFAD3-1基因的啟動(dòng)子長(zhǎng)度為2,038 bp;(2)EuFAD3-2基因的全長(zhǎng)cDNA序列為1,347 bp,共編碼448個(gè)氨基酸,氨基酸的分子量為50.92 kDa,等電點(diǎn)為9.01;EuFAD3-2基因組DNA序列的長(zhǎng)度為1,347 bp,無內(nèi)含子;已克隆到EuFAD3-2基因的啟動(dòng)子長(zhǎng)度為2,201 bp。3.以杜仲Actin為內(nèi)參基因,利用熒光定量PCR技術(shù)研究FAD3基因分別在‘華仲6號(hào)’和‘華仲10號(hào)’種仁發(fā)育不同時(shí)期中的表達(dá)模式:(1)EuFAD3-1基因在‘華仲6號(hào)’和‘華仲10號(hào)’種仁發(fā)育過程中均是先上升后下降,并分別在花后110 d和150 d達(dá)到最大值;(2)FAD3-2基因在‘華仲6號(hào)’種仁發(fā)育過程中先上升后下降,最后又上升,并在花后110 d達(dá)到最大值;FAD3-2基因在‘華仲10號(hào)’種仁發(fā)育過程中先下降后上升至最大值(花后100 d),最后又下降。4.根據(jù)已克隆出來的兩個(gè)FAD3基因全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)特異引物,利用pDNOR222.1載體和含有YFP熒光蛋白的表達(dá)載體(nYFP-CD3 686)構(gòu)建含有目的基因的融合表達(dá)載體,電擊法轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中,并注射到野生型小葉煙草的葉片中,在LSM510激光共聚焦顯微鏡下用Marker共定位后,觀察目的基因的亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果表明,杜仲兩個(gè)FAD3基因均定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。5.采用DNA重組技術(shù)成功構(gòu)建了pCAMBIA1304-35s-EuFAD3-1和pCAMBIA1304-35s-EuFAD3-2兩個(gè)植物超表達(dá)載體,電擊法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中,葉盤法侵染煙草葉片并用抗生素篩選陽性植株。以陽性煙草植株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和GUS染色兩種方法鑒定陽性植株,分別得到30株和36株轉(zhuǎn)基因煙草陽性株/系,分別選取其中的9個(gè)株/系的成熟種子通過高效氣相色譜法進(jìn)行脂肪酸成分分析,結(jié)果顯示,相對(duì)對(duì)照(野生型)而言,pCAMBIA1304-35s-EuFAD3-1和pCAMBIA1304-35s-EuFAD3-2轉(zhuǎn)化系的煙草種子中α-亞麻酸的含量分別增加了4.27%和0.92%,而亞油酸的含量分別降低了3.86%和0.65%,其他脂肪酸成分變化不顯著。pCAMBIA1304-35s-EuFAD3-1轉(zhuǎn)基因煙草種子中α-亞麻酸的含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于FAD3-2的。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S792.99

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1332781