發(fā)布時間：2017-12-25 05:23

  本文關(guān)鍵詞：NDV調(diào)控PI3K介導(dǎo)的信號通路研究　出處：《華南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染引起的一種高度接觸性傳染病。強毒NDV能引起感染鳥類消化道和呼吸道出血或中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。自1926年在印度尼西亞和1927年在英國首次暴發(fā)ND以來,該疾病現(xiàn)已呈全球分布,包括亞洲、歐洲、非洲和南美洲等全球六大洲都曾多次報道過ND的疫情。目前在全球的多個國家以Class I、Class II基因VI型和基因VII型的NDVs流行和傳播為主;但如基因XVII型和基因XVIII型等新型的NDV毒株不斷在非洲等國家出現(xiàn)。NDV的宿主范圍非常廣,能感染超過250種鳥類,而野鳥一直被認(rèn)為是NDV的天然宿主和傳播載體,帶毒的野鳥可能通過直接接觸在鳥類,甚至在家禽間傳播該疾病,對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失,然而目前帶毒的野鳥和家禽之間的傳播模式仍然有待進一步研究。因此,從2010年開始,我們對廣東省活鳥市場進行NDV的流行病學(xué)監(jiān)測,并且進一步研究在不同宿主上分離到的NDV對不同鳥類的致病性和傳播特性。在本研究中,從廣東省活鳥市場中雞、鴨和鴿等宿主中分離到25株NDVs,并對這25株NDVs的基因型和致病特性進行了分析。為了模擬活鳥市場不同種鳥類的自然傳播特性,選擇了其中5株分別分離于雞(GM)、鴨(SS-10、NH-10和YF18)、鴿(GZ289)不同宿主的代表性毒株,研究它們分別對雞、鴨和鴿不同宿主的致病性和傳播特性。對雞、鴨和鴿通過點眼滴鼻方式分別以106 EID50接種病毒,感染8 h后,分別在每個感染組的實驗動物中放置相對應(yīng)的3個同居對照動物做水平傳播實驗。實驗結(jié)果表明廣東省內(nèi)活鳥市場存在多種NDV的基因型,并且來源不同的鳥類有不同的組織趨性和宿主范圍。病毒感染與致病是病毒和宿主相互作用的結(jié)果,既有病毒為逃避宿主防御機制而發(fā)揮抗病毒作用,維持自身的復(fù)制,也有宿主為清除病毒而調(diào)動固有免疫體系迅速產(chǎn)生效應(yīng)分子和免疫效應(yīng),構(gòu)建機體抵御病毒入侵的生物防線。為了闡明NDV的致病機制,本研究通過NDV感染雞胚成纖維(Chicken embryo fibroblast,CEF)細(xì)胞在病毒感染早期短暫激活PI3K/Akt信號通路,并且在NDV感染CEF細(xì)胞15 min后觀察到Akt磷酸化。而NDV激活A(yù)kt的磷酸化在感染后1 h達到頂峰,感染24 h后逐漸減弱。紫外滅活的NDV也能夠激活PI3K/Akt信號通路,表明激活這條信號通路并不需要病毒復(fù)制。另外,在NDV感染CEF細(xì)胞前先用PI3K特異性抑制劑LY294002或者Wortmannin處理CEF細(xì)胞后再用NDV感染處理過的細(xì)胞,能夠明顯觀察到Akt的磷酸化被抑制了,同時NDV病毒滴度也減少。最后,網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞作用的抑制劑甲基-β-環(huán)糊精和氯丙嗪能夠抑制GM和F48E9毒株誘導(dǎo)的Akt磷酸化,卻對疫苗毒La sota誘導(dǎo)的Akt磷酸化沒有明顯影響,提示NDV侵入細(xì)胞可能與PI3K/Akt信號通路有關(guān)。然而,抑制PI3K/Akt信號通路的激活能夠加強NDV感染CEF細(xì)胞早期誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡反應(yīng),如Caspase 3和PARP裂解加強、GSK 3β磷酸化減少和Annexin V-FITC/PI染色的凋亡細(xì)胞增多。此外,泛半胱天冬酶抑制劑ZVAD-FMK和PI3K抑制劑LY294002能夠通過抑制細(xì)胞凋亡促進PI3K激活,導(dǎo)致Akt磷酸化增多和病毒復(fù)制增強,同時促進NDV感染的細(xì)胞宿主生存,提示PI3K/Akt信號通路具有抗凋亡作用和促進NDV復(fù)制。根據(jù)底物特異性和序列同源性,PI3K分為3類:class I、class II和class III。PI3K I類激活A(yù)kt/mTOR信號通路,促進營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝活動抑制自噬,然而PI3K III類Vps34結(jié)合Vps15轉(zhuǎn)換PI為PI(3)P促進自噬的發(fā)生。NDV既能誘導(dǎo)自噬,也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。盡管細(xì)胞凋亡和自噬承擔(dān)不同的形態(tài)特征和生理過程,然而兩者之間存在錯綜復(fù)雜的相互作用仍然不明確。因此為了深入闡明NDV的致病機制和探討NDV與宿主細(xì)胞相互作用的分子機制,本研究分析了NDV誘導(dǎo)PI3K介導(dǎo)的自噬和細(xì)胞凋亡對NDV復(fù)制的作用。在本研究中,相對于陰性對照組,NDV感染或者饑餓誘導(dǎo)CEF細(xì)胞在早期能觀察到LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化、p62/SQSTM1發(fā)生降解和通過透射電子顯微鏡觀察到自噬體增多等現(xiàn)象,表明NDV感染或者饑餓誘導(dǎo)CEF細(xì)胞能夠誘導(dǎo)自噬。然而紫外滅活的NDV感染CEF細(xì)胞卻沒有能夠觀察到LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化、p62/SQSTM1降解等現(xiàn)象,同時Caspase 3和PARP也未發(fā)生裂解,說明自噬體的產(chǎn)生需要病毒復(fù)制。在體內(nèi)外NDV感染實驗發(fā)現(xiàn),NDV感染早期可以觀察到Caspase 3和PARP分裂以及通過FITC-V/PI染色的凋亡細(xì)胞數(shù)均表明抑制自噬能夠加強細(xì)胞凋亡反應(yīng)。類似地,誘導(dǎo)自噬減少細(xì)胞凋亡反應(yīng)。此外,除了Beclin 1,誘導(dǎo)自噬能夠增加NDV感染SPF雞的脾臟和肺臟中的自噬相關(guān)基因、抗凋亡因子(Bcl-2和Bcl-x L)和促炎癥因子(IL-6和IL-1β)的表達水平,同時減少脾臟和肺臟中的凋亡細(xì)胞。然而半胱天冬酶通用抑制劑ZVAD-FMK抑制細(xì)胞凋亡能夠促進LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化和p62/SQSTM1發(fā)生降解,同時還能夠增強病毒復(fù)制,表明抑制NDV感染CEF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡能夠促進自噬的發(fā)生和細(xì)胞生存。綜上所述,研究結(jié)果揭示了PI3K/Akt信號通路和自噬與細(xì)胞凋亡的關(guān)系對NDV感染宿主細(xì)胞的分子機制,這將有助于理解NDV與宿主細(xì)胞相互作用的分子機制和NDV的致病分子機制,為ND的防控提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：1331535