本文關(guān)鍵詞：在綿羊圍附植期母胎對話中miRNA的表達特征及其對相關(guān)基因表達的影響　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：胚胎附植及妊娠建立,無論對人類生殖健康,還是家畜繁殖都有具有重要意義。附植和妊娠過程一直是生殖生理學(xué)研究的重點和難點,這個過程涉及到母體與胎兒之間的相互協(xié)同作用,需要營養(yǎng)代謝、免疫容受、內(nèi)分泌、血液循環(huán)、子宮內(nèi)膜重塑、細胞粘附等諸多環(huán)節(jié)的動態(tài)、精確的同步調(diào)控。在胚胎附植期間,孕體與母體子宮內(nèi)膜之間需要建立一種相互協(xié)調(diào)的對話關(guān)系,即母胎對話,異常母胎對話往往導(dǎo)致妊娠失敗。目前,雖然已經(jīng)報道了許多激素和細胞因子參與母胎對話過程,然而對于這一過程中整體的基因表達特征還不清楚。此外,miRNA作為重要的基因表達重要的調(diào)控方式,在母胎對話中的作用尚無系統(tǒng)報道。本研究采用包括轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)、蛋白質(zhì)組(Proteome)、小RNA測序(Small RNA-seq)等高通量的分析手段,為深入系統(tǒng)地解析其復(fù)雜的生物學(xué)過程提供參考。本研究以小尾寒羊為研究對象,在其妊娠第17天,對附植窗口期的孕體和子宮內(nèi)膜取樣,并通過數(shù)字表達譜(Digital Gene Expression, DGE)測序分析得到小RNA、以及轉(zhuǎn)錄組,并且運用高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)聯(lián)用獲得蛋白組數(shù)據(jù),然后結(jié)合生物信息學(xué)分析,進行如下研究：(1)通過分析小RNA數(shù)據(jù)預(yù)測羊孕體和子宮內(nèi)膜中新miRNA (Novel miRNA)并對其編輯率進行分析。利用MiRDeep2軟件,在測序獲得的小心A數(shù)據(jù)庫中檢測出110個已知miRNA,并預(yù)測得到405個潛在新]miRNA (Potential novel miRNA)。去掉有二級結(jié)構(gòu)錯誤的miRNA之后,獲得376個候選新miRNA (Candidate novel miRNA).然后將孕體、子宮阜和子宮阜間區(qū)的總miRNA編輯率比較,子宮內(nèi)膜：miRNA的編輯率在第9位明顯高于孕體,而在第12位恰好相反。另外,本研究對所有具體miRNA編輯率分析,發(fā)現(xiàn)其在不同組織中編輯率也存在明顯差異。部分miRNA在第2、5和16位編輯率差異明顯,表明miRNA的編輯率在不同的組織間呈現(xiàn)多樣化特征。(2)將孕體和子宮內(nèi)膜包括子宮阜區(qū)(Canrucular areas, C area)和子宮阜間區(qū)(Inter-caruncular areas, IC areas)的基因表達進行聚類分析,分成不同表達模式基因簇(Cluster),并分別對各組之間進行兩兩比較,然后將不同表達模式基因以及兩兩比較的差異表達基因用Gene Ontology, Revigo, String和KEGG pathway等軟件進行基因功能富集分析。發(fā)現(xiàn)在孕體中高表達的基因主要富集在能量代謝,粘附和細胞周期等條目。而在C區(qū)中高表達的基因富集在粘附、免疫等條目。IC區(qū)的大部分基因富集在細胞因子分泌、粘附、細胞形態(tài)發(fā)育等條目。深入分析轉(zhuǎn)錄組結(jié)果發(fā)現(xiàn)很多粘附和胞外基質(zhì)分子都在孕體和子宮內(nèi)膜高表達,暗示在附植窗口期這些分子起到重要作用。(3)通過miRNA數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的整合分析,進一步分析miRNA在母胎對話中的作用。利用TargetScan、miranda和RNAhybrid三種靶基因預(yù)測軟件對差異miRNA的靶基因預(yù)測。然后將差異miRNA的靶基因和差異表達基因取交集,并將篩選出的miRNA靶基因進行功能富集,發(fā)現(xiàn)一批候選miRNA可能作為調(diào)控因子參與母胎對話的功能調(diào)控。例如OAR-MIR-432在子宮內(nèi)膜中低表達,上調(diào)其靶基因Fermt3、Pard6a、Stat2和Tspan31分別可能參與細胞粘附,遷移,分化增殖；細胞分裂與極化；IFNT-tau識別的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和跨膜轉(zhuǎn)運等功能。進一步,本研究將差異miRNA的靶基因和差異蛋白整合分析,發(fā)現(xiàn)某些miRNA直接對基因翻譯有抑制作用,而不影響mRNA。例如OARl 12343在孕體中上調(diào),其靶基因是Co17al,其mRNA豐度不變化,而蛋白豐度下調(diào),說明OAR1_12343可能直接抑制翻譯過程而不對mRNA產(chǎn)生影響。(4)本研究用羊為研究對象比較了孕體和子宮內(nèi)膜(子宮阜區(qū)和子宮阜間區(qū))中IVP和IVO組中轉(zhuǎn)錄組表達譜。我們鑒定了附植第17天的差異表達基因。通過GO和KEGG富集分析我們發(fā)現(xiàn)孕體的差異基因主要富集在細胞粘附,細胞周期；子宮阜區(qū),差異基因主要富集在細胞凋亡,細胞粘附；子宮阜間區(qū)中,差異基因主要富集在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)運。這些差異基因是進一步研究IVP誘導(dǎo)的胚胎附植失敗的潛在關(guān)鍵基因。另外,本研究通過比較體內(nèi)、外兩種條件下產(chǎn)生的胚胎,其成功或失敗妊娠基因表達譜的差異,篩選出妊娠成功的特征基因。本研究將體內(nèi)外兩種條件下成功和失敗妊娠的表達譜進行比較,獲得共有的差異基因。結(jié)合已經(jīng)發(fā)表文獻對相關(guān)基因功能報道,篩選成功妊娠的候選特征基因。發(fā)現(xiàn)Pletl、Mx2、Ifit3、Ifitl等基因在成功妊娠中特異高表達,可能為成功妊娠的特征基因。本研究利用多個層次的高通量測序手段,首次在羊孕體和子宮內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)大量新miRNA,并且通過]miRNA組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組整合分析發(fā)現(xiàn)大量可能參與綿羊母胎對話基因表達調(diào)控的miRNA,其中部分miRNA是首次在綿羊中報道。另外呈現(xiàn)了附植窗口期母胎對話的轉(zhuǎn)錄組情況,并發(fā)現(xiàn)很多粘附和胞外基質(zhì)分子在此階段有重要作用。通過體內(nèi)、外兩種條件下成功與失敗附植比較,篩選出成功附植的關(guān)鍵候選基因。這些信息將為今后研究綿羊miRNA和母胎對話調(diào)控機制提供有效的參考。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S826;Q78
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本文編號：1331283