本文關(guān)鍵詞：NS3蛋白對乙型腦炎病毒增殖的影響及其宿主互作蛋白的篩選　出處：《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：流行性乙型腦炎是由乙型腦炎病毒(JEV)引起的一種主要經(jīng)蚊蟲傳播的人畜共患傳染病,對人類健康與養(yǎng)豬業(yè)產(chǎn)生極大危害。JEV感染宿主細(xì)胞具有一個完整的復(fù)制周期,包括吸附、穿入、脫殼、合成、組裝與釋放。JEV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3是一個具有多種酶活性的蛋白,其在JEV感染與復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。乙腦病毒作為一個結(jié)構(gòu)較為簡單的病毒,宿主與病毒蛋白之間的相互作用被認(rèn)為是乙腦病毒致病的重要機(jī)制。本研究運(yùn)用RNAi技術(shù)研究JEV NS3基因的沉默對體內(nèi)和體外JEV增殖的影響,并利用酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù)篩選能與NS3蛋白互作的宿主細(xì)胞蛋白,旨在深入地了解NS3蛋白對JEV增殖的影響及其具體作用機(jī)制。本研究不僅為闡明乙腦病毒增殖機(jī)理提供重要理論依據(jù),還為抗病毒藥物靶點(diǎn)的研究開辟新的方向。1 NS3蛋白對乙型腦炎病毒增殖影響的研究設(shè)計了4個乙型腦炎病毒NS3基因的RNAi靶位點(diǎn),分別位于JEV基因組4656-4676、4827-4847、4916-4936與5361-5381位,將其插入表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo中,構(gòu)建了能夠?qū)hRNA導(dǎo)入細(xì)胞的重組表達(dá)質(zhì)粒pGP-shRNA,并證明了shRNA質(zhì)粒能夠特異性抑制NS3基因的表達(dá)。將shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BHK21細(xì)胞后,間隔24h感染JEV。JEV感染細(xì)胞72h后,收集病毒培養(yǎng)物,運(yùn)用熒光定量PCR,空斑減少實(shí)驗(yàn),間接免疫熒光與Western blot檢測JEV增殖量的變化。結(jié)果顯示4個shRNA表達(dá)質(zhì)粒對JEV的增殖均有不同程度的抑制作用。其中pGP-NS3-4質(zhì)粒(基因組5361-5381)抑制效果最為顯著,其使細(xì)胞中JEV mRNA的含量降低93.9%；病毒滴度下降大約950倍；間接免疫熒光結(jié)果顯示細(xì)胞中乙腦病毒數(shù)量明顯減少,Western blot結(jié)果顯示乙腦病毒結(jié)構(gòu)蛋白E蛋白含量顯著降低。將7日齡乳鼠分為7組,每組6只,4個pGP-shRNA質(zhì)粒分別每只腦內(nèi)接種2 μ g,接種24h后以10×LD_(50)的劑量進(jìn)行腦內(nèi)攻毒,攻毒5d后,取鼠腦制成10%組織懸液,應(yīng)用空斑減少實(shí)驗(yàn)測定病毒滴度。結(jié)果顯示4個shRNA質(zhì)粒均使乳鼠腦組織中JEV的病毒滴度顯著降低,其中pGP-NS3-4質(zhì)粒(基因組5361-5381)效果最佳,使毒價下降大約2400倍。又將pGP-NS3-4質(zhì)粒接種3周齡小鼠,間隔24h以不同劑量攻毒,結(jié)果顯示pGP-NS3-4質(zhì)粒能為3周齡小鼠提供一定保護(hù),10×LD_(50)攻毒組保護(hù)率高達(dá)70%,50×LD_(50)攻毒組保護(hù)率為60%。本研究證明了NS3蛋白對JEV的增殖具有重要作用,同時發(fā)現(xiàn)了JEV基因組5361-5381位是一個高效的NS3基因沉默靶位點(diǎn),針對該位點(diǎn)的基因沉默對JEV在體內(nèi)外增殖具有顯著的抑制作用。該研究為乙腦病毒NS3蛋白功能以及其作為抗乙腦病毒靶點(diǎn)的深入研究提供了重要支持。2 乙型腦炎病毒NS3蛋白宿主細(xì)胞互作蛋白篩選以JEV野毒分離株SCYA201201為模板,擴(kuò)增全長NS3基因,并將其插入pGBKT7載體構(gòu)建了P GBKT7-NS3誘餌質(zhì)粒。隨后將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母菌Y2HGo]d,獲得了誘餌酵母菌,并對誘餌酵母菌進(jìn)行了包括毒性、自激活驗(yàn)證和蛋白表達(dá)鑒定,結(jié)果顯示NS3片段的插入對誘餌酵母菌沒有毒性作用,NS3基因沒有自激活作用并且誘餌酵母菌能成功表達(dá)全長NS3蛋白。采用Gold Yeast Two-Hybrid System系統(tǒng)將構(gòu)建的誘餌酵母菌與人腦組織cDNA文庫酵母菌進(jìn)行酵母雙雜交,連續(xù)在DDO/X/A 和 QDO/X/A營養(yǎng)缺失平板上篩選,經(jīng)過三輪的篩選,最終獲得了21個陽性克隆子。陽性克隆子經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,利用文庫質(zhì)粒的抗性篩選出單克隆,提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序分析,結(jié)果顯示除了8個重復(fù)序列、4個非編碼區(qū)序列和1個移碼突變序列外,最終獲得了8個NS3宿主互作蛋白的編碼基因序列,將這些序列在NCBI上進(jìn)行Blast分析,結(jié)果顯示它們與Genban k中的參考序列相似性均高達(dá)99%以上。隨后將這8個文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌Y187株,構(gòu)建獵物酵母菌,并將之與NS3誘餌酵母菌進(jìn)行回復(fù)雜交驗(yàn)證,同時設(shè)立文庫菌自激活對照組,結(jié)果顯示8個雜交菌落均呈現(xiàn)陽性,自激活對照組全為陰性,回復(fù)驗(yàn)證成功。本研究成功從人腦組織cDNA文庫中篩選獲得8個新的宿主互作蛋白,其分別是：腓骨蛋白FBLN5、蛋白磷酸脂酶PPP2CB、CRBN蛋白、G蛋白偶聯(lián)受體GPR137B、泛素結(jié)合酶UBE2N、鋅指蛋白ZNF350、熱激蛋白Hsp40和信號復(fù)合體蛋白COP9。這些互作蛋白的成功篩選為深入研究NS3蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及NS3蛋白參與JEV增殖的機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。3 乙型腦炎病毒NS3蛋白與宿主細(xì)胞蛋白相互作用的驗(yàn)證本研究運(yùn)用了免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證宿主互作蛋白與乙腦病毒NS3蛋白的相互作用。首先提取人腎上皮細(xì)胞(293細(xì)胞)的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以該cDNA為模板分別擴(kuò)增出了8個互作蛋白的編碼基因,并插入真核表達(dá)載體pCMV-HA構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒。同時將乙腦NS3基因插入另一真核表達(dá)載體pEGFP構(gòu)建了pEGFP-NS3真核表達(dá)質(zhì)粒。將這些質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞進(jìn)行表達(dá),Western blot結(jié)果顯示乙腦病毒NS3蛋白與6個宿主互作蛋白可以成功表達(dá)。將NS3真核表達(dá)質(zhì)粒與互作蛋白表達(dá)質(zhì)粒一對一組合,共轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24h,非變性裂解細(xì)胞,收集蛋白。運(yùn)用免疫磁珠法沉淀蛋白互作復(fù)合物,收集共沉淀產(chǎn)物,進(jìn)行SDS-PAGE與Western blot檢測。結(jié)果顯示宿主細(xì)胞中的熱激蛋白Hsp40 (DNAJB6)可與乙腦病毒NS3蛋白在293細(xì)胞中發(fā)生相互結(jié)合,是乙腦病毒NS3蛋白的宿主互作蛋白。本研究首次證實(shí)了熱激蛋白Hsp40 (DNAJB6)是乙型腦炎病毒NS3蛋白的宿主互作蛋白,該蛋白可能與乙腦病毒的增殖密切相關(guān),本研究為NS3蛋白介導(dǎo)JEV增殖的分子機(jī)制的研究提供了重要支撐。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65;R373.31

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本文編號：1329633