發(fā)布時(shí)間：2017-12-24 15:37

  本文關(guān)鍵詞：鯰魚魚鰾的比較轉(zhuǎn)錄組研究及趨化因子的表達(dá)分析初探其耐低氧機(jī)制　出處：《華東師范大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：氧氣是水生生物賴以生存的重要環(huán)境因子。尤其對(duì)于高密度的水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè),低氧作為常見的一種環(huán)境壓力,一方面能夠直接引起窒息而造成養(yǎng)殖魚類的大量死亡;另一方面能夠減緩魚的生長(zhǎng)速率,降低魚的免疫力,使其更容易感染各種病菌,從而造成大量的經(jīng)濟(jì)損失。鯰魚(Ictalurus spp.)原產(chǎn)于北美,不僅是美國主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖物種,也因其優(yōu)良的抗逆性、極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值在我國被廣泛養(yǎng)殖。相比較于很多其他的養(yǎng)殖魚類,鯰魚對(duì)低氧環(huán)境具有更好的耐受性,是一種理想的研究魚類低氧耐受機(jī)制的物種。加之鯰魚養(yǎng)殖業(yè)也同樣因?yàn)榈脱鯁栴}而遭受著巨大的損失,因此研究鯰魚對(duì)低氧脅迫的響應(yīng)機(jī)制,可以為選育耐低氧鯰魚提供理論依據(jù),對(duì)提高水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)業(yè)效率、提高經(jīng)濟(jì)收入具有十分重要的意義。之前對(duì)鯰魚耐低氧的研究主要集中在對(duì)某些特定基因。近年來,基于第二代高通量測(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)有助于我們從整體水平上研究特定組織處于某個(gè)狀態(tài)下基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的情況。本研究之前,鯰魚的多個(gè)組織器官(如鰓、皮膚、腸道、肝臟、肌肉、性腺等)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)陸續(xù)被報(bào)道,分別揭示了與鯰魚免疫、生長(zhǎng)發(fā)育、性別決定等相關(guān)的機(jī)理。然而作為為鯰魚提供平衡和浮力的器官,魚鰾的轉(zhuǎn)錄組一直以來被忽略。因此本研究的第一個(gè)目的就是填補(bǔ)鯰魚魚鰾的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的空白,從分子層面揭示鯰魚魚鰾的潛在功能;其次,常見養(yǎng)殖的鯰魚有斑點(diǎn)叉尾洶[亦稱溝鯰(Channelcatfish)]、長(zhǎng)鰭叉尾洶[亦稱藍(lán)鯰(Blue catfish)]及二者雜交的子代(C×Bhybrid catfish)。三種鯰魚最顯著的區(qū)別之一在于魚鰾形狀的差異:Chanel catfish的魚鰾是一個(gè)心形、沒有隔膜的單室,Blue catfish的魚鰾是一個(gè)狹長(zhǎng)的、被隔膜從中間隔開的雙室,而Hybrid catfish的魚鰾也是雙室,一端是相對(duì)較大的心形室是而另一端是相對(duì)較小的凸起。這使得鯰魚成為研究魚鰾形態(tài)學(xué)的很好的對(duì)象。因此本研究第二個(gè)目的就是通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究,發(fā)掘鯰魚魚鰾生長(zhǎng)發(fā)育及形態(tài)差異相關(guān)的基因及其表達(dá)模式。長(zhǎng)期以來真骨魚的魚鰾與哺乳動(dòng)物的肺在進(jìn)化學(xué)上被認(rèn)為是同源器官,這個(gè)觀點(diǎn)雖然已經(jīng)從形態(tài)學(xué)和胚胎學(xué)中找尋到一定的證據(jù),且在斑馬魚魚鰾中有一定探究,但在分子層面仍缺乏足夠的理論支持,因此本研究的第三個(gè)目的就是揭示涉及鯰魚魚鰾生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的重要基因及代謝通路,為魚鰾和肺的同源性提供分子層面的理論支持;之后通過施加低氧脅迫,我們從轉(zhuǎn)錄組層面研究鯰魚魚鰾對(duì)低氧脅迫的響應(yīng),探究鯰魚魚鰾潛在的輔助呼吸作用及鯰魚魚鰾中免疫相關(guān)基因?qū)Φ脱趺{迫的應(yīng)答規(guī)律;最后,我們基于鯰魚魚鰾比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究結(jié)果,從眾多差異表達(dá)基因中選取了最具代表性之一的趨化因子(chemokine),通過生物信息學(xué)的分析方法對(duì)其進(jìn)行鑒定和注釋得到完整的鯰魚趨化因子及趨化因子受體超家族,并對(duì)其進(jìn)行低氧脅迫及細(xì)菌感染的表達(dá)量分析,旨在揭示鯰魚趨化因子超家族對(duì)低氧脅迫及細(xì)菌侵染的表達(dá)響應(yīng),進(jìn)而為鯰魚低氧脅迫對(duì)免疫系統(tǒng)的影響提供新的視野。本論文取得如下研究成果:1.基于形狀不同的三種鯰魚魚鰾的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究,發(fā)掘魚鰾生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因及其表達(dá)模式分析。本研究以三種鯰魚(Channel catfish、Blue catfish 及 C ×B hybrid catfish)幼魚(Fingerlingcatfish,4個(gè)月)、成魚(Adultcatfish,2年)的魚鰾為實(shí)驗(yàn)材料,分別構(gòu)建6個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫(CA、CF、BA、BF、HA及HF),并采用Illunima HiSeq v4高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,共得到轉(zhuǎn)錄本平均長(zhǎng)度為100bp的原始數(shù)據(jù)115.92 Gb。通過修剪及標(biāo)準(zhǔn)化等轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)前處理,共有101.57Gb的數(shù)據(jù)(含1.04×1010條clean reads)被用于后續(xù)分析。將測(cè)序所得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)用genome-guided方法,比對(duì)到鯰魚基因組,計(jì)算表達(dá)量和差異表達(dá)基因(DEGs),結(jié)果顯示六個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫中均有超過62%的轉(zhuǎn)錄本可以比對(duì)到鯰魚基因組上�；诒磉_(dá)量的主成分分析(PCA)顯示,三種鯰魚種間差異大于同種鯰魚內(nèi)發(fā)育階段差異,且相比較于Channel catfish,Hybrid catfish與Blue catfish差異相對(duì)較小,表達(dá)規(guī)律更相似。同一發(fā)育階段的Channel catfish,Hybrid catfish與Blue catfish魚鰾轉(zhuǎn)錄組兩兩配對(duì)比較共發(fā)現(xiàn)4,612個(gè)顯著差異表達(dá)基因。其中Channel catfish和Blue catfish魚鰾的差異表達(dá)基因占較大比重,在幼魚和成魚中分別找到3,346和1,639個(gè)差異表達(dá)基因。在Channel catfish與Hybrid catfish比較轉(zhuǎn)錄組分析中,在幼魚和成魚中分別找到603和338個(gè)差異表達(dá)基因。在Blue catfish與Hybrid catfish比較轉(zhuǎn)錄組分析中,在幼魚和成魚兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別找到239和270個(gè)差異表達(dá)基因。分層聚類分析將差異表達(dá)基因分成9簇,并顯示Hybridcatflsh與Blue catfish表達(dá)規(guī)律更相似。KEGG注釋顯示2362個(gè)差異表達(dá)基因參與涉及魚鰾魚鰾生長(zhǎng)發(fā)育、結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的多個(gè)信號(hào)代謝通路中�；诓町惐磉_(dá)基因及信號(hào)通路分析,本研究可得到如下結(jié)論:(1)相比于Channel catfish,Hybrid catfish魚鰾轉(zhuǎn)錄組與Blue catfish的魚鰾轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)規(guī)律更相似,差異表達(dá)基因數(shù)量更少,揭示了鯰魚子代魚鰾形態(tài)上更像父本(Paternal predominant)的遺傳規(guī)律;(2)本研究所發(fā)掘的在鯰魚魚鰾生長(zhǎng)發(fā)育過程中參與的Wnt信號(hào)通路和Hedgehog信號(hào)通路的某些差異表達(dá)基因在哺乳動(dòng)物肺的生長(zhǎng)發(fā)育中也起著至關(guān)重要的作用,因而在分子層面為鯰魚魚鰾與哺乳動(dòng)物肺的同源性提供了支持;(3)鯰魚魚鰾轉(zhuǎn)錄組的差異表達(dá)基因還參與到與細(xì)胞黏附分子(Cell adhesion molecules)和黏著斑(Focaladhesion)密切相關(guān)的信號(hào)通路,以及與聲波傳導(dǎo)相關(guān)的信號(hào)通路等,全面的揭示了鯰魚魚鰾潛在的功能�？偠灾�,通過對(duì)不同形態(tài)的鯰魚魚鰾的比較轉(zhuǎn)錄組分析,我們解釋了鯰魚魚鰾轉(zhuǎn)錄組的基本表達(dá)規(guī)律,發(fā)現(xiàn)魚鰾的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)模式與結(jié)構(gòu)及功能密切相關(guān)。同時(shí),一些和魚鰾功能相關(guān)的重要基因和信號(hào)通路也被篩選出來,為將來更深入的魚鰾功能研究奠定了基礎(chǔ)。2.通過高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示鯰魚魚鰾對(duì)低氧脅迫的響應(yīng)機(jī)制。本研究以最常見養(yǎng)殖鯰魚斑點(diǎn)叉尾洶(Channelcatfish)為研究對(duì)象,選取低氧脅迫后的幼年(4個(gè)月)、成年(2年)鯰魚魚鰾組織及空白對(duì)照組的幼年、成年鯰魚魚鰾為實(shí)驗(yàn)材料,分別構(gòu)建其轉(zhuǎn)錄組文庫,并采用Illunima HiSeq v4高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,共得到轉(zhuǎn)錄本平均長(zhǎng)度為100bp的原始數(shù)據(jù)52.98 Gb。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)前處理,共有45.53Gb的數(shù)據(jù)(含4.69×109條clean reads)被用于后續(xù)分析。將測(cè)序所得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以鯰魚基因組為參照進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示六個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫中均有超過三分之二的序列可以比對(duì)到鯰魚基因組上�；诒磉_(dá)量的主成分分析(PCA)顯示,低氧脅迫前后幼魚魚鰾轉(zhuǎn)錄組表達(dá)模式差異較大而成魚魚鰾對(duì)低氧脅迫響應(yīng)較小。分析差異表達(dá)基因結(jié)果顯示,幼年鯰魚魚鰾在低氧脅迫前后共發(fā)現(xiàn)3053個(gè)差異表達(dá)基因,其中表達(dá)上調(diào)的基因有2397個(gè),下調(diào)的有656個(gè)。在成魚魚鰾在低氧脅迫前后共發(fā)現(xiàn)477個(gè)差異表達(dá)基因,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于幼魚魚鰾的差異表達(dá)基因數(shù)量,其中表達(dá)上調(diào)的基因有288個(gè),下調(diào)的有189個(gè)。這些基因涉及多個(gè)和魚鰾功能相關(guān)的信號(hào)通路,包括與魚鰾生長(zhǎng)密切相關(guān)的以及低氧脅迫相關(guān)的及與免疫相關(guān)的chemokine信號(hào)通路�；诓町惐磉_(dá)基因及其所參與的信號(hào)通路分析可到如下幾個(gè)結(jié)論:(1)Wnt和Hedgehog信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物肺的發(fā)育過程中起至關(guān)重要作用的兩條通路,本研究在幼魚魚鰾的差異表達(dá)基因基因中發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因參與到上述兩條通路中,再次證實(shí)了鯰魚魚鰾與哺乳動(dòng)物肺的同源性關(guān)系,然而在成魚轉(zhuǎn)錄組中并未發(fā)現(xiàn)參與上述兩條通路的基因,這說明隨著鯰魚發(fā)育完全后,參與魚鰾發(fā)育的相關(guān)基因表達(dá)量下降;(2)參與氧氣存儲(chǔ)、氧氣運(yùn)輸?shù)裙δ艿牟町惐磉_(dá)基因(如Hemoglobin)在成魚及幼魚中均有發(fā)現(xiàn),但幼魚中遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于成魚,這從基因表達(dá)量層面證明了鯰魚魚鰾的輔助呼吸的功能,并且我們可以推斷鯰魚魚鰾在其幼年時(shí)有更重要的輔助呼吸作用,而成年后輔助呼吸作用變?nèi)?(3)參與免疫作用的相關(guān)基因(如chemokine)在成魚和幼魚魚鰾轉(zhuǎn)錄組中均觀察到普遍表達(dá)量下降的趨勢(shì),這說明低氧脅迫會(huì)抑制魚的免疫反應(yīng),使其更容易感染各種致病菌;(4)成魚、幼魚魚鰾轉(zhuǎn)錄組中某些差異基因參與與低氧響應(yīng)密切相關(guān)的HIF-1,MAPK及PI3K/Akt/mTor信號(hào)通路,揭示了鯰魚魚鰾對(duì)低氧脅迫的響應(yīng)機(jī)理。3.從鯰魚基因組中系統(tǒng)的鑒定出完整的CXCL趨化因子亞家族成員,并研究其對(duì)低氧脅迫及細(xì)菌侵染的響應(yīng)。我們從鯰魚基因組中系統(tǒng)的鑒定出一套完整的包含17個(gè)成員的CXCL趨化因子亞家族成員。以模式生物斑馬魚的CXCL趨化因子為參照,我們通過系統(tǒng)發(fā)生樹分析,對(duì)這17個(gè)鯰魚CXCL趨化因子基因進(jìn)行了系統(tǒng)命名。這17個(gè)CXCL趨化因子包含3個(gè)CXCL8成員、3個(gè)CXCL11成員、2個(gè)CXCL12成員、1個(gè)CXCL13成員、1個(gè)CXCL14成員、3個(gè)CXCL18成員、1個(gè)CXCL19成員及3個(gè)CXCL20成員。共線性分析顯示鯰魚CXCL趨化因子所在染色體區(qū)域上下游的基因與斑馬魚對(duì)應(yīng)區(qū)域基因分布結(jié)構(gòu)保守,蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示這17個(gè)CXCL趨化因子成員均含有保守的CXC結(jié)構(gòu)域,因此這17個(gè)CXCL趨化因子的鑒定及命名得到了驗(yàn)證。比較基因組學(xué)分析揭示了硬骨魚特有的CXCL18、CXCL19、CXCL20和CXCL32成員的存在,以及由硬骨魚三次基因組復(fù)制(3R)而導(dǎo)致的CXCL趨化因子數(shù)量的擴(kuò)增。細(xì)菌侵染及低氧脅迫后,CXCL趨化因子呈現(xiàn)基因特異性表達(dá)。CXCL12a、CXCL12b、CXCL18b及CXCL20.3在愛德華氏菌(E.ictaluri)侵染后顯著差異表達(dá)且均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì);CXCL11.3、CXCL18a.2、CXCL18b及CXCL20.3在柱狀黃桿菌(F.columnare)侵染后差異表達(dá)且大部分差異表達(dá)基因上調(diào),揭示了 CXCL11、CXCL12、CXCL18及CXCL20在鯰魚免疫應(yīng)答中潛在的的重要作用。在愛德華氏菌侵染后,CXCL11.3和CXCL20.3的表達(dá)量在抗病菌鯰魚中顯著高于易感染鯰魚;在柱狀黃桿菌侵染后,CXCL20.2的表達(dá)量在抗病菌鯰魚中顯著高于易感染鯰魚。低氧脅迫后,CXCL12b表達(dá)量在耐低氧鯰魚中顯著高于不耐低氧鯰魚。總而言之,CXCL11和CXCL20及CXCL12可分別用來指示鯰魚的抗病菌感染和耐低氧性;細(xì)菌侵染及低氧脅迫會(huì)引起大部分CXCL趨化因子的高表達(dá)。4.從鯰魚基因組、轉(zhuǎn)錄組及EST數(shù)據(jù)庫中鑒定出完整的CCL趨化因子亞家族成員,并研究其對(duì)低氧脅迫及細(xì)菌侵染的響應(yīng)。我們從鯰魚基因組、多個(gè)轉(zhuǎn)錄組及EST數(shù)據(jù)庫中篩選出64個(gè)CCL趨化因子亞家族成員。以模式生物斑馬魚的CCL趨化因子為參照,我們通過系統(tǒng)發(fā)生樹分析,對(duì)這64個(gè)鯰魚CCL趨化因子基因進(jìn)行了系統(tǒng)命名。這64個(gè)CXCL趨化因子包含3個(gè)CCL19成員、4個(gè)CCL20成員、2個(gè)CCL25成員、3個(gè)CCL27成員、2個(gè)CCL32成員、9個(gè)CCL33成員、7個(gè)CCL34成員、1個(gè)CCL35成員、24個(gè)CCL36成員、8個(gè)CCL39成員及1個(gè)CCL44成員。共線性分析顯示鯰魚CCL趨化因子所在染色體區(qū)域上下游的基因與斑馬魚對(duì)應(yīng)區(qū)域基因分布結(jié)構(gòu)保守,蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示這64個(gè)CCL趨化因子成員均含有保守的CC結(jié)構(gòu)域,因此這64個(gè)CCL趨化因子的鑒定及命名得到了驗(yàn)證。比較基因組學(xué)分析揭示了硬骨魚特有的 CCL32、CCL33、CCL34、CCL35、CCL36、CCL38、CCL39 和CCL44成員的存在,以及由硬骨魚三次基因組復(fù)制(3R)而引起的CCL趨化因子數(shù)量的大量擴(kuò)增。與其他模式物種CCL趨化因子相似,鯰魚CCL趨化因子在染色體也呈現(xiàn)成簇分布的規(guī)律,主要的兩簇分布在第7和第8條染色體上,分別包含18個(gè)和15個(gè)基因。CCL19、CCL34及CCL36的成員在愛德華氏菌和在柱狀黃桿菌侵染后均呈現(xiàn)差異表達(dá),且大部分差異表達(dá)基因呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì);CCL19a.1、CCL19a.2及CCL19b均在易感染愛德華氏菌的鯰魚中具極很高的表達(dá)量,揭示了 CCL19在鯰魚免疫響應(yīng)中發(fā)揮重要的重要作用。低氧脅迫后,不耐低氧的鯰魚中差異表達(dá)基因CCL27a、CCL34a.1及CCL34a.2均顯著上調(diào),而耐低氧的鯰魚中僅CCL36.4顯著上調(diào),其余三個(gè)差異表達(dá)基因顯著下調(diào)。由此可見,與CXCL趨化因子亞家族相似,鯰魚中某些CCL趨化因子的高表達(dá)與對(duì)病菌的易感和不耐低氧相關(guān)聯(lián)。5.從鯰魚基因組中鑒定出完整的CCR趨化因子受體及CXCR趨化因子受體,并研究其對(duì)低氧脅迫及細(xì)菌侵染的響應(yīng)。我們從鯰魚基因組及多個(gè)轉(zhuǎn)錄組中篩選出30個(gè)CCR趨化因子受體和8個(gè)CXCR趨化因子受體。以模式生物斑馬魚為參照,我們通過系統(tǒng)發(fā)生樹分析,對(duì)這38個(gè)鯰魚趨化因子受體基因進(jìn)行了鑒定和命名。30個(gè)CCR趨化因子受體包含2個(gè)CCR6成員、1個(gè)CCR7成員、11個(gè)CCR8成員、2個(gè)CCR9成員、1個(gè)CCR10成員、11個(gè)CCR11成員、2個(gè)CCR12成員、1個(gè)CXCR1成員、1個(gè)CXCR2成員、3個(gè)CXCR3成員、2個(gè)CXCR4成員及1個(gè)CXCR5成員。共線性分析顯示鯰魚CCR和CXCR趨化因子受體所在染色體區(qū)域上下游的基因與斑馬魚對(duì)應(yīng)區(qū)域基因分布結(jié)構(gòu)保守,蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示這64個(gè)CCL趨化因子成員均含有保守的7TMGPCR結(jié)構(gòu)域,因此這38個(gè)鯰魚趨化因子受體基因的鑒定及命名得到了驗(yàn)證。比較基因組學(xué)分析揭示了硬骨魚特有的CCR11及CCR12成員的存在,以及由硬骨魚三次基因組復(fù)制(3R)而引起的CCR趨化因子數(shù)量的擴(kuò)增。大部分差異表達(dá)的趨化因子受體基因在愛德華氏菌和在柱狀黃桿菌侵染后均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),其中CXCR3和CXCR4成員在兩種細(xì)菌侵染過程中均有參與。此外,CXCR3.2和CXCR4b分別在愛德華氏菌侵染后的易感染鯰魚和抗病鯰魚中顯著上調(diào),揭示了 CXCR3和CXCR4在鯰魚免疫響應(yīng)中發(fā)揮重要的重要作用。低氧脅迫后,CCR9a和CXCR4b在耐低氧及不耐低氧的鯰魚中均顯著上調(diào),且在耐低氧鯰魚中表達(dá)量更高,揭示了 CCR9和CXCR4在鯰魚耐低氧相應(yīng)中的重要作用。此外,CXCR4b和CCR9a在低氧脅迫及細(xì)菌感染后均顯著上升,可能解釋了低氧脅迫和細(xì)菌入侵的某種聯(lián)系�？傊�,鯰魚趨化因子及趨化因子受體超家族的鑒定及對(duì)低氧脅迫和細(xì)菌感染的響應(yīng)將為魚類比較免疫學(xué)和生理學(xué)的研究提供寶貴的研究基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 孟艷青;劉曉飛;劉洋;常亞青;王秀利;姜志強(qiáng);;大菱鲆趨化因子受體CCR3和CCR9基因的克隆及組織表達(dá)[J];中國水產(chǎn)科學(xué);2013年05期

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本文編號(hào)：1328961