發(fā)布時(shí)間：2017-12-24 00:00

  本文關(guān)鍵詞：奶牛金葡菌乳房炎抗性的全基因組DNA甲基化表達(dá)調(diào)控及候選基因功能驗(yàn)證　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：金黃色葡萄球菌(金葡菌,Staphylococcus aureus S.aureus)是從隱性乳房炎奶牛乳汁中分離到的最常見的病原微生物之一,是導(dǎo)致奶牛隱性乳房炎最主要的接觸傳染性致病菌。奶牛金葡菌乳房炎是一種復(fù)雜疾病,具有潛伏期長,持續(xù)性感染,易產(chǎn)生耐藥性等特征,目前尚無有效的疫苗,給奶牛場造成了極為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。奶牛金葡菌乳房炎受環(huán)境與病原菌的共同影響,遺傳力較低,僅從病原菌角度或遺傳學(xué)角度均難以對(duì)其進(jìn)行有效的防控,而表觀遺傳學(xué)的興起為奶牛乳房炎的研究提供了新的策略。DNA甲基化是相對(duì)穩(wěn)定且可遺傳的表觀遺傳修飾,抑制基因的表達(dá),可作為研究奶牛金葡菌乳房炎等復(fù)雜疾病的切入點(diǎn)。因此本研究針對(duì)金葡菌隱性乳房炎牛和健康牛之間DNA甲基化的修飾差異以及調(diào)控模式展開研究,并構(gòu)建奶牛金葡菌乳房炎體外細(xì)胞模型,研究奶牛金葡菌乳房炎抗性候選基因的功能和葉酸提高奶牛金葡菌乳房炎抗性的分子機(jī)理,為有效控制奶牛金葡菌乳房炎及其分子抗病育種提供遺傳和表觀遺傳基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:試驗(yàn)一:選取三頭金葡菌隱性乳房炎牛和三頭無金葡菌感染的健康牛為試驗(yàn)對(duì)象,采用MeDIP-chip技術(shù)鑒定外周血淋巴細(xì)胞全基因組啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化模式及修飾差異。共發(fā)現(xiàn)1078個(gè)差異甲基化基因,其中金葡菌隱性乳房炎牛相對(duì)于健康牛,上調(diào)甲基化基因有527個(gè),下調(diào)甲基化基因有551個(gè)。DNA甲基化分布模式表現(xiàn)為:染色體亞端粒區(qū)甲基化水平顯著高于非亞端粒區(qū),DNA甲基化水平在TSS附近顯著下降,且DNA甲基化負(fù)調(diào)控基因表達(dá)主要發(fā)生在金葡菌隱性乳房炎牛TSS上游1kb區(qū)。與表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析,共發(fā)現(xiàn)58個(gè)差異甲基化且差異表達(dá)基因,其中MST1、NRG1和NAT9基因的DNA甲基化差異與奶牛金葡菌隱性乳房炎炎癥相關(guān),可作為潛在的金葡菌隱性乳房炎抗性候選基因。試驗(yàn)二:牛乳腺上皮細(xì)胞系Mac-T是一株具有正常乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)與特征的永生化細(xì)胞系,正越來越多的被應(yīng)用于乳房炎致病菌與宿主細(xì)胞的互作研究中。通過qRT-PCR方法檢測金葡菌對(duì)Mac-T細(xì)胞的粘附和入侵,結(jié)果表明,Saue.和MRSA分別在90min和1Omin中的粘附力最強(qiáng);S.aueus和MRSA分別在8h和6h時(shí)的侵襲力最強(qiáng);且MRSA對(duì)Mac-T細(xì)胞的粘附能力和侵襲力極顯著地強(qiáng)于S.aureus。通過對(duì)Mac-T細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間的攻菌處理,結(jié)果顯示S.aureus和MRSA的最佳攻菌時(shí)間為6h,建立了 S.aureus和MRSA感染的奶牛金葡菌乳房炎體外細(xì)胞模型。試驗(yàn)三:選取TRAPPC9和JAK2作為奶牛金葡菌乳房炎抗性候選基因,利用RNA干擾技術(shù)對(duì)每個(gè)基因分別進(jìn)行表達(dá)沉默。對(duì)基因干擾成功的細(xì)胞進(jìn)行體外攻菌試驗(yàn),結(jié)果顯示Saureu.或MRSA感染導(dǎo)致TRAPPC9和JAK2基因mRNA表達(dá)水平顯著下降,TRAPPC9基因的沉默可抑制NRG1、MST1和NAT9基因的表達(dá),而TRAPPC9和JAK2基因的沉默會(huì)上調(diào)促炎細(xì)胞因子(IL6、IL1β)及趨化因子(IL8)的表達(dá),從而增加金葡菌對(duì)Mac-T細(xì)胞的刺激作用。這些結(jié)果表明TRAPPC9和JAK2基因具有抑制金葡菌乳房炎炎癥反應(yīng)的作用,可作為奶牛金葡菌乳房炎抗性關(guān)鍵基因。試驗(yàn)四:在建立的奶牛金葡菌乳房炎體外細(xì)胞模型中,通過添加葉酸探究葉酸對(duì)奶牛金葡菌乳房炎的影響。結(jié)果表明葉酸通過促進(jìn)金葡菌乳房炎抗性候選基因(TRAPPC9、JAK2、MST1、NAT9和NRG1)的表達(dá)及抑制炎癥細(xì)胞因子(IL6、IL1β和IL8)的釋放來抵抗金葡菌的入侵,達(dá)到緩解金葡菌乳房炎炎癥反應(yīng)的目的,且具有劑量效應(yīng),最佳處理濃度為5μg/mL。并提出"葉酸提高奶牛金葡菌乳房炎抗性的分子機(jī)理"假說:葉酸通過抑制NF-κB和JAK-STAT信號(hào)通路上相關(guān)的誘導(dǎo)因子IL8和IL6的表達(dá)來緩解奶牛金葡菌乳房炎炎癥反應(yīng),對(duì)防控奶牛金葡菌乳房炎具有一定的積極作用。綜上,本研究從表觀基因組和分子遺傳學(xué)方面深入挖掘奶牛金葡菌乳房炎抗性候選基因及進(jìn)行功能驗(yàn)證,并探究了葉酸提高奶牛金葡菌乳房炎抗性的分子機(jī)理,為奶牛金葡菌乳房炎的表觀遺傳調(diào)控及分子抗病育種提供了數(shù)據(jù)支持和科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.23

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1326002